材料

缓冲液和溶液

试剂、缓冲液、储液的组成参见附录1,储液使用前稀释到适当浓度。

去离子蒸馏水（冰预冷）

ddNTP,4种ddNTP储液（5mmoI/L)

dNTP,4种dNTP储液（lmmol/L)

甲酰胺加样缓冲液
10x标记混合液和ddNTP延伸/终止混合液
当测序模板富含二級结构时，用等摩尔7-脱氨-2"-dGTP代替10X标记混合液和ddNTP延伸/终止混合液中的dGTP。

酶和缓冲液
5x反应缓冲液
200mmol/LTris-Cl(pH8.8)
25mmol/LMgCl₂

Taq酶（5u/ul）或类似的热稳定DNA聚合酶

Taq酶稀释缓冲液
25mmol/LTris(pH8.8)
0.01mmol/LEDTA(pH8.0)
0.15%Tween-20
0.15%NP-40
从其他生物体提取的热稳定酶的反应条件和反应缓冲液可能稍有不同。不同酶的最适缓冲液条件见制造商提供的使用说明书，单位热稳定DMA聚合酶的活性通常定义为：在70~80°C，反应30min将10nmol核苷酸转化为酸沉淀形式所需酶量为1个酶活性单位。

核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物
浓度为1.0pmol/pl(约6.6ng/ul),溶于TE(pH7.6)中。
对于一些结合于靶区域上游载体序列的通用引物，可参见第8章信息栏“通用引物”及本章末尾信息栏“DNA测序寡核苷酸引物储液制备”。



模板DNA(100ug/ul)溶于TE(pH7.6)中

每一套测序反应需要500ng的单链DNA或1.0ug的变性双链质粒DNA。变性双链线性DNA,并使它与引物复性。即先把天然模板DNA与过量的引物混合，在沸水浴中加热约2min,然后把试管插入冰水浴中。不要让混合液温度回升，立刻使用。
小规模制备M13噬菌体重组于单链DMA的浓度一般在0.05到0.5ug/ml的范围内。这取决于特定噬菌体的生长速度。在正常的Taq酶催化的测序反应情况下，棋板DMA是过量的。因而每次测序反应中模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量。可参见方案4的疑难解答。

放射性化合物

[a-³²P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)或
[a-³⁵S]dATP(1000Ci/mmol,10mCi/ml)或
[a-³³P]dATF(2000—4000Ci/mmol，~10mCi/ml)或

5"³²P标记的寡核苷酸引物

若不用放射性标记dATP作为内标记，也可以用5‘端以³²P或³³P标记的寡核苷酸引物进行测序反应。此时，可用1.0~1.5pmol放射性标记引物和2ul水代替反应中未标记引物和放射性标记dATP(步骤1),其他步骤相同。一般用多核苷酸激酶催化ATP的[γ-³²P]转移至寡核苷酸5’末端。详细情况见第10章的方案2。

专用设备

微量离心管（0.5ml)或微量滴定板（柔韧，耐热，每孔容量为300ul的U型孔96孔板）。
参见信息栏“微量滴定板”

装有多孔加热板的程控热循环仪（如Dri-Blockcyclers,Techne公司）。
其次可选用45°C和72°C的水浴。见第8步的说明，

可加热到65°C的水浴。

方法

1.在0.5ml微量离心管或微量滴定板孔中加入:

单链模板DNA(250fmd)(100ng/ul)                          5.0ul
寡核苷酸引物（0.5pmol)(约3.3ng/ul)                     3.0ul
5x反应缓冲液                                                         20.ul

2.在65°C温育密封的微量离心管2min。从水浴中取出离心管，使之在3~5min内冷却到室温。
有些实验人员喜欢用小加热板或装水的烧杯，使该退火反应在30min的过程中缓慢却。我们实验中发现，这两种方法的实验结果相同。

3.在引物和模板降温时，融化10X标记混合液、ddNTP延伸/终止混合液和放射性标记的dATP,融化后置于冰上。

4.在每一彩色标记的0.5ml微量离心管或每一个提前标有C、T、A和G的微量滴定板孔中加入4ul与其相对应的ddNTP延伸/终止混合液（如标记为C的微量离心管和微量滴定板孔加入4ulddCTP混合液，标记为T的微量离心管和微量滴定板孔加入4ulddTTP混合等），并将微量离心管或微量滴定板置于冰上。

5.按1:8比例稀释足够的热稳定DNA聚合酶用于所有模板测序，例如：

TaqDNA聚合酶（5~101u/ul)
酶稀释缓冲液7ul
每一组四种测序反应需要2ul(2u)稀释酶。酶终浓度应约为lu/ul。稀释后的酶要一直放在冰上贮存。

6.把下列物质加入到备退火反应管中（上述步骤2):

10x标记混合液                                              2ul
放射性标记dATP                                           0.5ul
稀释的DNA聚合酶（约1u/ul)                        8ul
涡旋振荡混匀，然后在45°C温育反应5min。

7.转移4ul标记反应液到含有相应的双脱氧终止混合液的C、T、A、G各管或微量滴定板各孔中（上述步骤4),沿微量离心管和微量滴定板孔壁加入。

8.把小离心管放入微量离心机内（用合适的转头或适合0.5ml离心管的衔接头，或把它们放入去盖的1.5ml离心管中），或者把微量滴定板放入配有合适衔接头的离心机中，以2000r/min离心C、T、A和G各管或滴定板几秒钟，混合反应物。72°C温育5min。
把小离心管或滴定板放在高效加热块中温育，也可以放在水、油或其他导热效率高的介质中。若放在72°C空气温箱中，在这样短的温育过程中达不到TaqDNA聚合酶所需的理想温度，

9.加入4ul甲酰胺加样缓冲液终止反应。

10.这些反应物在-20°C时最多可保存5天，也可以用变性凝胶电泳直接分析（见方案8、9或10、11和12)。热变性后（100°C,2min)，在冰上快速冷却。取C、T、A和G反应物各3ul加入测序凝胶的各孔中。