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| 实验材料 | pMQ402 试剂、试剂盒 | 阿拉伯糖苯甲基磺酰氟Ni-NTA琼脂糖结合缓冲液清洗缓冲液洗脱缓冲液透析缓冲液 仪器、耗材 | 超声破碎器冷冻离心机 实验步骤 | 3.方法 此处列出的方法概括了为定点突变而做的氨基酸位点选择（见3.1)、为在细菌细胞中表达而做的MutH蛋白突变（见3.2)和MutH变体的鉴定（见3.3)。 3.1为定点突变对氨基酸的选择 从生物技术信息国家中心基因组基本局部比对搜索工具（basic local alignment searchtool，BLAST)页面（http://www. ncbi. nlriLnih. gov/BLAST/)[24]得到MutH蛋白和相关限制性内切核酸酶的序列。更多的序列从PSIBLAST服务器[25]得到。使用PAM250矩阵，用ClustalX程序比对序列。比对好的序列用GeneDoc程序分析[27]。程序的使用方法可在程序内使用“Help”功能得到。结构的坐标从PDB数据库（http: //www. rcsb. org/pdb/)得到。程序RasWin和Swiss PDB viewer用于结构观察。 3.1.1与DNA结合有关的保守残基团的辨别 在序列比对（如用ClustalW或ClustalX)之后，完成下列步骤。 (1)将比对结果输入GeneDoc程序（见2.1；参考文献[27])。 (2)用“Group”功能将序列分组（如一个组包含MutH，而另一个组包含限制性(切核酸酶)。 (3)鉴别组特异的残基（见注1)。 (4)用GeneDoc内的“RasMolScript Dialog”功能，生成RasMol执行文稿，以将组特异残基映射入（标记在）MutH蛋白结构中。 (5)将MutH结构载入RasMol程序（见2.1；参考文献[28])，在“RasMolCommand Line”用“Script”命令执行从GeneDoc输出的文稿，以观察组特异残基。 (6)辨别位于假设为DNA结合位点的候选残基。 3.1.2辨别接触特定碱基的残基 (1)下载限制性内切核酸酶与DNA底物（或产物）形成复合物的现有序列。 (2)运行SwissPDBviewer，以3个催化残基（如MutH的D70、E77和K79)的主链原子为种子，将限制性内切核酸酶结构与目标MutH结构进行匹配。 (3)用“Improve fit”功能增强拟合效果。 (4)将重叠结构的坐标输出到电子制表程序。 (5)计算目标蛋白（如MutH)的任意原子到重叠结构中碱基的距离，此碱基对应于目标蛋白中的目标碱基。 (6)对所有重叠结构，重复这些步骤。 (7)计算平均距离，并辨认对感兴趣碱基距离最近的残基。 (8)将结果与组特异残基分析比较。 (9)为定点突变选择有希望的残基。 3.2MutH变体定点突变 MutH变体的克隆，采用如Kirsch和Joly所述[29]修改过的QuikChange操作规程(Stratagen)，用质粒 pMQ402(来自Dr.M.G.，University of Massachusetts MedicalSchool，MA)为模板，以及两个寡聚脱氧核苷酸用于突变以适合于产生长度在50~500bp的PCR产物（见注2)。 3.3MutH变体的纯化和鉴定 为了适合于体外测试，MutH变体必须得到纯化。 3.3.1从细菌细胞纯化MutH变体 (1)用细菌质粒以标准分子生物学方法转化XL-1BlueMRF细胞。 (2)将细胞平铺在含有氨苄青霉素的LB培养板上，于37°C过夜培养。 (3)选一单菌落，在500ml含75μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，于37°C生长。 (4)在600nm处光密度值为0.8时，于28°C，用0.2%(m/V)阿拉伯糖（终浓度）诱导2.5h(见注3)。 (5)以3000g离心细胞10min。 (6)重悬细胞团于10ml结合缓冲液中[见2.3(9)]。 (7)用Branson超声机，输出级5，占空率50%，超声破碎悬浮物5次，每次1min。每次超声间歇冷却溶液1min。 (8)在冷冻离心机上，以30000g离心细胞碎片30min。 (9)于4°C，将上清液与Ni-NTA琼脂糖浆柔和地混合30min。 (10)将Ni-NTA琼脂糖移至一空柱中。 (11)用20ml清洗缓冲液冲洗该柱[见2.3(10)]。 (12)用0.5ml洗脱缓冲液[见2.3(11)]洗脱。没有必要切除His标记，因其不干扰内切酶活性（见注4)。 (13)以在280nm处的光密度值作为判断依据，收集合并得到的每份蛋白质。 (14)于4°C，用500ml透析缓冲液[见2.3(12)]透析样品最少2h。换缓冲液2次。 (15)用500ml透析缓冲液G[见2.3(13)]透析样品。 (16)在透析缓冲液[见2.3(12)]中以1:10比例稀释样品，测量280nm处的光吸收，以便用理论消光系数计算MutH的摩尔浓度[30]。 (17)于-20°C保存蛋白质。 3.3.2MutH的切割分析 用含有未甲基化、半甲基化或全甲基化的单个d(GATC)位点（图7.3)的DNA底物（用它处所描述的方法合成的寡核苷酸，或者PCR产物，参考文献[19]和[20])来开展MutH和MutH变体的切割分析。用不同的荧光染料、（分别用FAM和TET)标记底物上下两端的链，以便检测每条链上的切割。  (1)10nmol/L浓度的DNA底物在10μl含有500nmol/L的MutL和浓度在10~500nmol/L的MutH的测试缓冲液（见注1；误，似应为2.4节，第1条——译者）中保温（见注5)。 (2)反应混合物于37°C温育。 (3)以适当的时间间隔（10s到30min)分装反应混合物，每份含25fmolPCR产物，与12μl模板抑制剂（Perkin-Elmer)和0.5μlGene-Scan-500TAMRAsizestandard (Perkin-Elmer)充分混合。 (4)加热到95°C2min，并立即在冰上冷却。 (5)在配有47cm(内径50μm)毛细管（其中含有加了8mol/L尿素的POP-4聚合物（Perkin-Elmer))的 ABIPRISM310基因分析仪（Perkin-Elmer)上分析样品。 (6)用5s，将样品电注入毛细管，使用电压15000V，并在15000V和60°C、使用1X基因分析缓冲液外加1mmol/LEDTA (Oerkin-Elmer)作为电极缓冲液，使用30min完成跑电泳过程。 (7)记录切割的和未切割的荧光标记的DNA数量（图7.3)。 (8)测定切割速度。 |
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发布于 ： 2019-06-26
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