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Peptides

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P2000014Adipokinetic Hormone IIfrom Schistocera gregariaPyr-Leu-Asn-Phe-Ser-Thr-Gly-Trp-NH2C44H60N11O12
P2000015Adipokinetic HormonePyr-Leu-Thr-Phe-Thr-Ser-Trp-Gly-NH2C44H60N10O12
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P2000018Adrenomedullin (13-52),humanSer-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp- Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2(Disulfide bridge:Cys16-Cys21)C200H308N58O59S2
P2000019Adrenomedullin (22-52),humanThr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2C159H252N46O48
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产品:利用二代测序完成基因组精细图 查看更多>
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两个基因大小分别230kb和450kb,酶切后,450kb的有目的条带,但很弱,230kb的质粒条带亮,其下方有一很微弱条带,用的酶分别是:Ncol和Spel体系是(Takara,两个酶切体系不同,用的官网推荐体系):

NcoI1μl

Spel1μl

10×KBuffer2μl
0.1%BSA2μl
DNA3ul
灭菌水upto20μl37℃4h电泳1h

利用NheI和HindIII双酶切插入目的片段,为什么双酶切有目的片段和切开的质粒,测序却没有?

并且测序后在NheI位点后的序列变成了-GGCTAGGTAC-Kpn位点(CGTTTAAACTTAAGCTTG消失。之前和之后的序列都相符),之间的怎么都没了?

1.TaqMan探针法 针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时,该探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来,破坏两荧光分子间的PRET,发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。
2.SNaPshot法 该技术由美国应用生物公司(ABI)开发,是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,也称小测序,主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中,引物延伸一个碱基即终止,经ABI测序仪检测后,根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点,根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析。
3.HRM法 高分辨率熔解曲线分析(HRM)是近几年兴起的SNP研究工具,它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况,来判断是否存在SNP,而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形,因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限,无需序列特异性探针,在PCR结束后直接运行高分辨率熔解,即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针,操作简便、快速,成本低,结果准确,并且实现了真正的闭管操作。
4.Mass Array法 MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具,通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDI-TOF-MS技术相结合,实现基因分型检测。基于MassARRAY平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高达40重的PCR反应和基因型检测,实验设计灵活,分型结果准确性高。根据应用需要,对数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时,MassARRAY具有最佳的性价比,特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证,或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。
5.Illumina BeadXpress法 采用Illumina公司的BeadXpress系统进行批量SNP位点检测,可以同时检测1-384个SNP位点,往往用于基因组芯片结果确认,适合高通量检测。微珠芯片具有高密度、高重复性、高灵敏度、低上样量、定制灵活等特点,极高的集成密度,从而获得极高的检测筛选速度,在高通量筛选时可显著降低成本。向左转|向右转
正在做bmp4启动子的一段序列,两端分别加的Sac1和Nhe1的位点,pcr之后跑胶显示条带位置正确,回收后分别与pgemt-easy载体和peasy-t5zero载体连接,连接之后单酶切和双酶切均显示连接成功,但测序结果就是不对,已经测了3次,求哪位大神指教一二,多谢了!!难道真的是pcr出的序列本来就是错的?而且连接peasy-t5zero载体后双酶切切不开。我用的Sac1和Nhe1是Thermo的,正在尝试换takara的重新双酶切。
pgem-teasy载体插入片段位点两侧各有一个EcoR1的位点。

从addgene买的质粒,送来的是菌液,划板培养,挑单克隆,小提后酶切鉴定正常,送去测序结果是双峰。根据公司的建议,重新挑克隆,结果还是双峰!后来换了一家公司,也是双峰。测序引物特异。

请教高人,这样的问题怎么解决?

多谢

目的片段用kpn1和xho1双酶切,然后连接到PGL4.10上,结果用RPV3测序出来目的序列是反向互补的,这是什么原因导致的?

我的目的蛋白D2,是膜表达蛋白,构建了三种载体的重组质粒,分别为CMV,pCDNA3.1,pEGFP-N1,三个重组质粒酶切正确、测序正确,也曾表达过,可以砸出相应大小的目的条带。大提过后,有近一个半月没有进行转染表达,突然发现我的质粒不能砸出目的条带了,甚至外源性的anti-Flag都砸不到(pEGFP重组质粒转染可以观察到微弱荧光,比以前较少),已经重修小提过,也重新进行了酶切,进行测序,都没有问题,现在就是砸不到条带(阳性对照的Flag每次都可以),请各位大神帮忙!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

片段长度143bp,酶切位点kpn1和Hind3,连入pGL3b载体,测序引物公司用的pGL3-,第一次反向测序不成功,原因是质粒出现重叠峰,正向加测后成功,对比发现下游引物的酶切位点(Hind3)少了一个碱基(aagtcc变成aagct),重组质粒酶切切不出插入片段;之后将测序成功的质粒重新转化DH5α,再提质粒酶切还是切不出来。质粒小提试剂盒Qiagen的,提取菌液1.5mL,浓度608.2ng/uL,酶切质粒2ug。
【之前构建的4个重组质粒里也有两个出现这样的问题(aagtcc变成agtcc),但是酶切能切出插入的片段】
目前问测序公司得到的答复是样品可能不是单克隆,测序结果是不准确的,建议重新挑取单克隆测序。
不知道还有没有别的方法?

最近在构建质粒,遇到奇怪的问题,向大牛们求助!!通过CDNA文库扩增目的基因片段后连接至载体上,转化后挑取克隆进行菌落PCR鉴定,选择阳性菌落扩增后提取质粒,再将质粒酶切鉴定,选择酶切结果正确的质粒送测序,通用引物测序结果显示上游测序结果为载体序列,无目的基因序列,下游引物无信号?!崩溃了,为嘛!我同一批做的其他几个质粒都没有问题,这个质粒构了两次了都这样。。。欲哭无泪啊,求大神们慷慨相助!!

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(Next-generation sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等,主要有以下几种:大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454 pyrosequencing)、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA 纳米球测序 (DNA nanoball sequencing)等。 基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

用takara的in-fusion方法做了个重组质粒,如左图PCR验证,右起第二道是空载质粒为模板的对照。右图是酶切验证,两个图片结合起来觉得除了第四个单克隆外,其他几个应该都可能是阳性克隆。结果送了1,2两个样品后测序的结果都不对。为什么会这样。