同源臂引物设计
2017-07-29
问题描述：
大家好，最近准备做基因敲除的实验，在引物设计的起步上就走不动了，基因上下游同源臂引物是怎么设计的，谢谢大家，现在实验进行不了了，请大家能告知，万分感谢！！！
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dxy_87tjxc76
用户
你是用red呢？还是crispr呢
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谢小丫1V0C
用户dxy_87tjxc76你是用red呢？还是crispr呢你说的redcrispr是基因重建和基因编辑一类的吗？之前没接触过，我用的是knockout，是基因打靶一类的，谢谢
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dxy_87tjxc76
用户谢小丫1V0C你说的redcrispr是基因重建和基因编辑一类的吗？之前没接触过，我用的是knockout，是基因打靶一类的，谢谢基因敲除的方法有很多种的，目前较新的是crispr，另外，你是敲真核呢？还是原核？
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dxy_87tjxc76
用户谢小丫1V0C你说的redcrispr是基因重建和基因编辑一类的吗？之前没接触过，我用的是knockout，是基因打靶一类的，谢谢还有你具体用的什么方法…你得说清楚啊
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谢小丫1V0C
用户dxy_87tjxc76还有你具体用的什么方法…你得说清楚啊我敲除的是结核分枝杆菌，用的是SOE-PCR。用的是卡那霉素替代该敲除基因。大概是先扩增出该引物的上下两段同源臂和卡那霉素，然后用SOE-PCR把它们融合在一起然后转到质粒里。我先从GenBank下载该基因序列，然后设计出该基因的上下游引物，但是关于上下游同源臂的引物不知道怎么设计，谢谢你告知！
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dxy_87tjxc76
用户嗯，你这个敲除的原理也是同源重组吗？
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谢小丫1V0C
用户dxy_87tjxc76嗯，你这个敲除的原理也是同源重组吗？嗯嗯，是的
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dxy_87tjxc76
用户谢小丫1V0C嗯嗯，是的大概懂你的意思了，你的意思是，首先分别通过PCR获得需要敲除基因两端的同源臂和卡纳抗性基因，然后通过OVERLAPPCR将这三个连起来，然后是通过同源重组把这三个连到质粒上？再通过电转转入目的菌株进行同源重组敲除，但是你的菌株本身表达重组酶吗？还是说文献中报道的这个菌株的敲除方法就是这样的，还是有些地方没有明白，OVERLAPPCR的话主要是在设计引物的时候加入同源臂吧？
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谢小丫1V0C
用户展开引用dxy_87tjxc76大概懂你的意思了，你的意思是，首先分别通过PCR获得需要敲除基因两端的同源臂和卡纳抗性基因，然后通过OVERLAPPCR将这三个连起来，然后是通过同源重组把这三个连到质粒上？再通过电转转入目的菌株进行同源重组敲除，但是你的菌株本身表达重组酶吗？还是说文献中报道的这个菌株的敲除方法就是这样的，还是有些地方没有明白，OVERLAPPCR的话主要是在设计引物的时候加入同源臂吧？......嗯嗯，这个主要是设计引物，引物很重要，上下游同源臂P出来，把替代目的基因的序列P出来，把三者融合，然后连到质粒上
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dxy_87tjxc76
用户谢小丫1V0C嗯嗯，这个主要是设计引物，引物很重要，上下游同源臂P出来，把替代目的基因的序列P出来，把三者融合，然后连到质粒上没做过overlap，我先前试过同源重组的方法进行连接的，也是两个同源臂连到质粒上，通过同源重组将同源臂连起来，并且连在质粒上，你感兴趣的话可以去搜下同源重组连接的方法
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dxy_87tjxc76
用户dxy_87tjxc76没做过overlap，我先前试过同源重组的方法进行连接的，也是两个同源臂连到质粒上，通过同源重组将同源臂连起来，并且连在质粒上，你感兴趣的话可以去搜下同源重组连接的方法话说蚂蚁淘上应该有关于overlap引物设计的方法和要求吧，你查查看
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谢小丫1V0C
用户dxy_87tjxc76话说蚂蚁淘上应该有关于overlap引物设计的方法和要求吧，你查查看嗯嗯，好的，谢谢
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