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【分享】我认为最好的在线引物设计软件
2007-02-09
问题描述:

看到版上经常还是有许多战友为引物的设计感到头疼。不过这也难怪,虽然原理我们都知道,但是设计的时候却未必能都考虑的很完全。
在这里我向大家隆重推荐一个在线的引物设计软件,是斯坦福大学的,我认为是最好的在线引物设计软件,我用它设计接近100多对引物,可以说是屡试不爽。它用起来也很简单,最重要的是效果非常好,考虑的因素也非常的多。
先不说那么多了:网址:http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
下面我继续图示。

帖子发表之后很多战友PM我,让我帮设计引物,其实这很让我失望的,我的本意是让大家掌握这种方法,而不是告诉大家我是一个专家,其实我水平也有限,所以我不会帮大家设计引物,我认为这是科研工作的一部分、基本功,祝大家好运、实验顺利。

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wujingjing
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给大家提供一些设计引物注意事项,这是有经验的教授告诉我的,他们用眼睛就能看出来:1.引物必须位于起始密码子与终止密码子之间,即CDS之间Start coding:AUG( atg ) Stop coding: UAA、UAG、UGA( taatagtga )2.要使目标序列与内参在同一胶中电泳 则扩增片断长度要差开。且Tm要互相接近3.引物终止于G或C比较好。
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simplexueping
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谢谢这位战友,可是我的基因出来的是这种结果怎么办?PrimersforPCRTherewere1forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere4reverseprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere1forwardprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere0reverseprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.ERRORTheTmrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange
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依医
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楼主你好!这个在线软件看起来比Oligo6.72、primer等软件简单,但该软件似乎只考虑了引物的长度范围、引物的退火温度、引物的GC含量范围,而没有关于引物之间能否形成二聚体方面的信息。而Oligo6.72评价引物则采取了多方面的评价,包括二聚体等信息,但缺点是提供了很多对引物,没有提供最好的,选择哪一对都要靠自己把握。比如我想设计wnt3amRNA的引物,基因系列见:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_033131.2。我把该基因序列copy进去后,提示TheGCrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange。按照楼主提供的方法降低minimumGC值但仍然出现该提示语,所以我将maximumGC改成90,此时出现TheTmrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange,故将MaximumTm改成70,此时出现Theendannealrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange,一直找不到---
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yunerwenyu
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首先输入你想要p的片断,含有数字也无所谓,选择pcr选项。
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yunerwenyu
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点击“submit”进入下面的页面。其中在SelectYEStoAmplifyaregionwithEXACTendpointsoftheDNAsequenceenteredNOYES这一项中,一定要选择yes,其他的各项目,大家可以点击查看说明,也都是非常的好理解。暂时,我们先不要改软件自设的默认值,直接submit
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yunerwenyu
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然后我们就得到了结果,它会把所有可能的引物都会列出来,而且会把最好的一对帮你挑选出来,ofcourse,我们要选择最好的。
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yunerwenyu
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然后点击“ThisistheBESTpairofprimers”就得到了设计好的引物。而且也会显示出“ThesequenceofDNAthatwillbeamplifiedbytheseprimersis”如果你不放心,你可以将该序列和你的原始序列比较一下,不会有问题的了。
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yunerwenyu
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当然这是最顺利的情况,但是有时并不是这么简单,例如我前两天帮一个战友设计引物,他想要的序列:atcgatcagattatcaAATaatataccaaaattgatacatatgatacatatgaatg721atatatgttttggatatattatttgttaaaattaattcatcaggtgatgatgtgatgata781atcattgaaaaatgacaaaaATCCcctgattaagtataataaaaatagtaagtaaaaaag841gcaaatttttacttacaaaatattacatattggaataaataatttaatctttcatatata901taactgtgatacatcataaatatatatatagcaaaagaaagatataaattattatcattt961tttttgatcattattgctataattattatcctgcttgtttaactataataatagcaatga1021atgaatcaaaatttaaatgatacgttaaaatccaaccaatatgttataaattttctttca1081ttt
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yunerwenyu
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我们直接提交得出的结果:
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yunerwenyu
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这样的话,按照默认的设的值并不能得到合适的引物,很明显如果让我们自己人工设,可能就不会考虑这么的详细:首先第一个问题,GC含量太低。
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yunerwenyu
  用户
为了重新设计,我们点击浏览器上的后退,回到前一页,也就是默认值的设定这一页。
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simplexueping
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谢谢这位战友,可是我的基因出来的是这种结果怎么办?PrimersforPCRTherewere1forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere4reverseprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere1forwardprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere0reverseprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.ERRORTheTmrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange
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yunerwenyu
  用户
我们可以改两个地方,第一,Optimumprimerlength:Minimumlength:Maximumlength:中,我们可以将Maximumlength改成一个更大的值,例如35;MinimumGC改成20,然后submit,可是我们发现还是有问题。
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yunerwenyu
  用户
这一次的原因是引物自己配对的问题,同样我们回到前一页,这次我们把SelfEndAnneal由原来的12改成16,submit。这样我们就得到了新的引物。
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yunerwenyu
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就这样,有时默认值不行的,可以微调一样,便很容易得到比较理想的引物。我用了那么久,几乎从来没有问题。大家可以随时点击【info】选项,进一步深入了解每个选项的意思。
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yunerwenyu
  用户
因为你太快了,请继续往下看呵呵展开引用simplexuepingwrote:谢谢这位战友,可是我的基因出来的是这种结果怎么办?PrimersforPCRTherewere1forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere4reverseprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere1forwardprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere0reverseprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.ERRORTheTmrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange......
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simplexueping
  用户
参数改了好多还是不行,要不你再帮我看看,谢谢了,呵呵1ggATCCccgggcagagctggggggggatttgttagcatctcttgataaacttAATtgtct61ctcgtcactgacggcacagagctattgatgggtctcaacccccagctagttgtcatcctg121ctcttctttctcgaatgtaccaggagccatatccacggatgcgacaaaaatcacttgaga181gagatcatcggcattttgaacgaggtcacaggagaagggacgccatgcacggagatggat241gtgccaaacgtcctcacagcaacgaagaacaccacagagagtgagctcgtctgtagggct301tccaaggtgcttcgcatattttatttaaaacatgggaaaactccatgcttgaagaagaac361tctagtgttctcatggagctgcagagactctttcgggcttttcgatgcctggattcatcg421ataagctgcaccatgaatgagtccaagtccacatcactgaaagacttcctggaaagccta481aagagcatcatgcaaatggattactcgtagtactgagccaccatgctttaacttatgaat541ttttaatggttttattttaatatttatatatttataattcataaaataaaatatttgtat601aatgt
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yunerwenyu
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看了结果你知道为什么你的引物为什么这么难以设计了,因为N端和C端的性质差别太大,属于极品的那种呵呵。展开引用simplexuepingwrote:参数改了好多还是不行,要不你再帮我看看,谢谢了,呵呵......
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yunerwenyu
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很多时候虽然它给出的结果看上去并不是那么好,但是用起来还是没有问题的。你试试我给你设计的这个吧。
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simplexueping
  用户
N端和C端的差别怎么看,参数怎样修改才好,不会每个都试一下吧,你怎么修改的参数,另外我设计出来的怎么都是上千的大片段,怎么改成几百的,我还有一个基因,可能也是极品,自己设计了两对,摸了n多的条件,到现在也没扩出来,多谢了,再帮帮忙,好人做到底了。呵呵gATAGCTGCCATCGGCTGACCTAGAGAAGACACATCAGCTGATCCTTTGG50ACCCTCTGACTTGAGACAGAAGTTCTGGGCTTCTCCTCCTGCGGCCTAGC100TCTGAGACAATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCT150CATGGCTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAG200AAAGTCTGAATAACTATTTTAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAG250AGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGAACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAA300AATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACCTCAGACTCTTTGAAGTCT350TGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTCATTGAATCACAC400CTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCATTCAT450GAGTATTGCCAAGTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCAT500TCAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTC550AGGAAGCGGAAAAGGAGTCGCTGCTGATTCGGGGTGGGGAAGAGATTGTC600CCAATAAGAATAATTCTGCCAGCACTATTTGAATTTTTAAATCTAAACCT650ATTTATTAATATTTAAAACTATTTATATGGAGAATCTATTTTAGATGCAT700CAACCAAAGAAGTATTTATAGTAACAACTTATATGTGATAAGAGTGAATT750CCTATTAATATATGTGTTATTTATAATTTCTGTCTCCTCAACTATTTCTC800TTTGACCAATTAATTATTCTTTCTGACTAATTAGCCAAGACTGTGATTGC850GGGGTTGTATCTGGGGGTGGGGGACAGCCAAGCGGCTGACTGAACTCAGA900TTGTAGCTTGTACCTTTACTTCACTGACCAATAAGAAACATTCAGAGCTG950CAGTGACCCCGGGAGGTGCTGCTGATGGGAGGAGATGTCTACACTCCGGG1000CCAGCGCTTTAACAGCAGGCCAGACAGCACTCGAATGaGTCAGGTAGTAA1050CAGGCTGTCCCTGAAAGAAAGCAGTGTCTCAAGAGACTTGACACCTGGTG1100CTTCCCTATACAGCTGAAAACTGTGACTACACCCGAATGACAAATAACTC1150GCTCATTTATAGTTTATCACTGTCTAATTGCATATGAATAAAGTATACCT1200TTGCAACC
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simplexueping
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自己搞了几个,好像要把整个都扩出来,太大了吧,不知道这样出来的引物行不行,条件放的太宽吧
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yunerwenyu
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1你怎么修改的参数?根据结果里面,哪一项不符合,然后适当的把条件放宽。2都是上千的大片段,怎么改成几百的?我看不懂:?)引物长度是有限制的啊3还有一个基因,可能也是极品授人以鱼,不如授人以渔,对不对?xbwl
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yunerwenyu
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这个非常好设计啊,把tm稍微降低就可以了啊,而且肯定也不会影响效率的啊
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simplexueping
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呵呵,谢谢yunerwenyu,我也是看那项不符合再修改那项,不知道这样放宽条件设计的引物好用吗,你有没有试过这样的能P出来吗?这个扩出来的是1208bp,太长了吧,引物长度是可以改,但是跟PCR产物的长度没有关系吧,我是想问怎么设计几百的PCR产物长度。多谢了,这个设计软件的网站很好用。
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yunerwenyu
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我试过,是没有问题的。
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bibliothèque_bak
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请教yunerwenyu:我需要在引物上引入酶切位点怎么办呢?就是有几个碱基会和模板不匹配,是直接把模板的相应位置的碱基修改之后再贴上去搜索引物吗?
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abigale98
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请问P的片段哪里搞呀
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shmily1031
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请教下要设计巢式PCR的引物又该怎么设计呢?要引入酶切位点又该怎么办呢?有联系方式吗?急~~~
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linshixia2006
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我现在按照你提供的网址检索大鼠的GnRH及受体的引物,象没有,不知道是我的操作问题,还是其他原因,你能帮我一下吗
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ABIgale98请问P的片段哪里搞呀你要扩的片段序列未知是吗?
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蜜蜂沫
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yunerwenyu你好,我根据你上面的信息做了设计,请你帮忙看一下这么改合适吗,谢谢!GetprimersPrimersforPCRTherewere0forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.ERRORTheGCrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange然后我将MinimumGC:40MaximumGC:70出来以下结果PrimersforPCRTherewere39forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere66reverseprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere19forwardprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere11reverseprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere19forwardprimerswithvalidselfannealvalues.Therewere11reverseprimerswithvalidselfannealvalues.Therewere19forwardprimerswithvalidselfendannealvalues.Therewere11reverseprimerswithvalidselfendannealvalues.Therewere209pairsofvalidprimers.ThisistheBESTpairofprimersListofallvalidpairsofprimers然后我用ThisistheBESTpairofprimers是不是就ok了
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wujingjing
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给大家提供一些设计引物注意事项,这是有经验的教授告诉我的,他们用眼睛就能看出来:1.引物必须位于起始密码子与终止密码子之间,即CDS之间Startcoding:AUG(atg)Stopcoding:UAA、UAG、UGA(tAATagtga)2.要使目标序列与内参在同一胶中电泳则扩增片断长度要差开。且Tm要互相接近3.引物终止于G或C比较好。
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xihsxsqq
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1cctccgaaaccatgaactttctgctctcttgggtgcactggaccctggctttactgctgt61acctccaccatgccaagtggtgaagttcatggacgtctaccagcgcagctattgccgtcc121AATtgagaccctggtggacatcttccaggagtaccccgatgagatagagtatatcttcaa181gccgtcctgtgtgcccctaatgcggtgtgcgggctgctgcaatgatgaagccctggagtg241cgtgcccacgtcggagagcaacgtcactatgcagatcatgcggatcaaacctcaccaaag301ccagcacataggagagatgagcttcctgcagcatagcagatgtgaatgcagaccaaagaa361agatagaacaaagccagaaaatcactgtgagccttgttcagagcggagaaagcatttgtt421tgtccaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggc481gaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccaaggcggtgagccgg541g版主:你好.以上是我的原文序列,麻烦你帮我设计一下引物好吗,谢谢!
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小鱼儿1982
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楼主你好!我想问一下,这个软件是不是只能设计已知片段的引物?但在许多情况下,我们所扩增的都是未知的片段,所以如果是设计未知片段的引物,有什么比较好的软件吗?谢谢楼主了!
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小鱼儿1982
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展开引用xihsxsqq1cctccgaaaccatgaactttctgctctcttgggtgcactggaccctggctttactgctgt61acctccaccatgccaagtggtgaagttcatggacgtctaccagcgcagctattgccgtcc121AATtgagaccctggtggacatcttccaggagtaccccgatgagatagagtatatcttcaa181gccgtcctgtgtgcccctaatgcggtgtgcgggctgctgcaatgatgaagccctggagtg241cgtgcccacgtcggagagcaacgtcactatgcagatcatgcggatcaaacctcaccaaag301ccagcacataggagagatgagcttcctgcagcatagcagatgtgaatgcagaccaaagaa361agatagaacaaagccagaaaatcactgtgagccttgttcagagcggagaaagcatttgtt421tgtccaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggc481gaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccaaggcggtgagccgg541g版主:你好.以上是我的原文序列,麻烦你帮我设计一下引物好吗,谢谢!我根据楼主的说明,把Tm值的范围改成了35-75,引物长度改为18-25,GG含量改为30-70,下面是结果PrimerPairData--------------------------------------------------------------------------------Primersfor1(Entered)TheseprimersareforPCRForward-PrimerCCTCCGAAACCATGAACTTTCTReverse-PrimerCCCGGCTCACCGCCTTGGCTTGTLength:22Length:23PercentGC:45PercentGC:69Tm:56Tm:72Self-Anneal:12Self-Anneal:16End-Anneal:4End-Anneal:8Offset:1Offset:541Pair-Anneal:14Pair-End-Anneal:8Totalvalidprimerpairs:8Theseprimerswillamplifyafragmentof541basepairsThesequenceofDNAthatwillbeamplifiedbytheseprimersis1CCTCCGAAACCATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTGCACTGGACCCTGGCT51TTACTGCTGTACCTCCACCATGCCAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTCTAC101CAGCGCAGCTATTGCCGTCCAATTGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGA151GTACCCCGATGAGATAGAGTATATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGCCCCTAA201TGCGGTGTGCGGGCTGCTGCAATGATGAAGCCCTGGAGTGCGTGCCCACG251TCGGAGAGCAACGTCACTATGCAGATCATGCGGATCAAACCTCACCAAAG301CCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTGCAGCATAGCAGATGTGAATGCA351GACCAAAGAAAGATAGAACAAAGCCAGAAAATCACTGTGAGCCTTGTTCA401GAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTCCAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTC451CTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACG501AACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCAAGGCGGTGAGCCGGG不知道可不可以,请指教!......
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libinchun
  用户
很好,感谢楼主共享,以后会请教的,呵呵