请教各位高手：

1.本人最近用权威文献中的引物PCR，使用前在NCBI上BLAST了一下，可是并没有结果。这个引物可用吗？

2.自己用OLIGO7设计了一对引物，评分良好，BLAST特异性好。可是实际一直P出某条非目的条带。退火温度也按TM值调节过了。实在想不出什么原因。

3.使用NCBI上的PRIMER-BLAST设计的引物，在NCBI自己的BLAST却找不到目的片段，这是为啥？引物可用吗？

谢谢！

我们在设计pcr引物的时候，经常需要将设计好的正反向引物与基因组DNA序列进行比对验证，但是因为反向引物是反向互补的，所以有些麻烦。因此，在这里介绍两个非常的小工具，一个是在线的模拟PCR，一个是本地运行的程序包，我会以附件形式上传，不需要蚁豆即可下载。两个都写得非常详细，相信大家都能看懂。不知道这个帖子能不能加分？希望版主看到后给予加分奖励

方法一：UCSC中的In-SilicoPCR

1、登录UCSC，网址链接http://www.genome.ucsc.edu/index.html，点击右侧工具的In-SilicoPCR，或者在Tools下拉框中点击In-SilicoPCR，如下所示：

2、点击In-SilicoPCR后，出现如下界面，我们需要将自己设计好的正向引物和反向引物分别粘贴至各自空白框，点击submit。对其它几个参数做点说明吧，MaxProductSize是指被放大区域的最大长度，MinPerfectMatch是指和引物的3‘末端PerfectMatch的最小碱基数目，MinGoodMatch:是指和引物的3‘末端GoodMatch的最小碱基数目，GoodMatch是3个碱基里最少匹配2个，FlipReversePrimer:反向引物反向互补。

3、我用自己设计的基因举例说明：HNF-1α的EXON2，参考序列：NM_000545，正向引物5’-3‘：CAGCCCTTGCTGAGCAGATCC，反向引物5’-3‘：CCACTGACTTCCTTTCCATCTACC。正向引物和反向引物分别粘贴至各自空白框，点击submit。出现如下结果，其中第一个红色标记指染色体位置，第二个红色标记指长度，第三个红色标记是我们输入的正反向引物，第四个标记可以直接链接至Primer3在线设计引物，网址http://primer3.ut.ee/。比对染色体位置就可以知道我们设计的引物是否包括HNF-1α的EXON2。

方法二：Reverse程序

这个程序是一位程序员朋友专门为我们编写的，操作非常简单，输入反向互补的引物序列后，就可以得到原始碱基序列。文件夹内一共才3个文件。

举例说明，HNF-1α的EXON2，参考序列：NM_000545，正向引物5’-3‘：CAGCCCTTGCTGAGCAGATCC，反向引物5’-3‘：CCACTGACTTCCTTTCCATCTACC。

1、点击target，粘贴反向引物序列。

2、点击右上角关闭键，这时候会弹出对话框，点击保存。

3、打开文件夹中的reverse_complement应用程度，按任意键即可自动关闭。

4、打开文件夹中的result，就可以得到反向互补引物序列对应的原始序列。

5、这时候就可以将正向序列和刚刚得到的原始序列一起代入HNF-1α的EXON2中检验我们设计的引物是否覆盖了目标片段。

好了，就这两个小工具了，非常实用，希望大家有所收获。有什么疑问可以给我留言或者私信我，支持我的战友就请给我投票吧。版主能给予我加分奖励吗？