【求助】紧急求助！标准曲线制作

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【求助】紧急求助！标准曲线制作

2021-07-24

问题描述：

我是一个新手。做了两次real-timePCR（SYBRGREENI）标准曲线都很差劲，请好心的大侠们帮忙指点迷津。

标准品是用质粒DNA做了。第一个图是按10倍梯度进行稀释,以10^3～10^9copy/μl7个浓度的标准模板系列作为标准品；第二个图是按10倍梯度进行稀释，以50～0.0005ng/ul6个浓度的标准模板系列作为标准品，得到的标准曲线的参数值分别是R^2＝0.87998694<0.99，Slope＝-1.403786（图一）；R^2＝0.9702126<0.99,slope=-1.5033078.

我应该从哪些方面来改进我的实验？紧急求助！

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winne_jin

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第二张图如下

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yulanwang

用户

我想从两个方面来回答你的问题，一，你的质粒标准品在进行稀释时，你稀释的准确吗，一般是多取一点原样进行稀释以减少稀释误差；二，你用的荧光染料SYBRGREENI，此种染料可以跟所有的双链DNA结合，包括引物二聚体，包括其它的非特异性扩增，不知道你分析了你的熔解曲线了没有，看看是不是只有一个峰？建议你把你的熔解曲线的图也传上来。标准曲线好的话一般要求R^2＝0.99以上呢，至少应该是两个9。

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winne_jin

用户

谢谢你。我是在别人实验室做的real-time，没有要到SDS的安装软件。明天我去把融解曲线拷下来，再请你看看。可能我稀释不准确，我是用TE稀释的，取1ul50ng/ul的溶液+9ulTE得到5ng/ul的溶液，再从1ul5ng/ul的溶液+9ulTE得到0.5ng/ul的溶液，以此类推，得到7个浓度的标准模板系列。是不是稀释不准确？

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