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【板绘】人物练习_ (゜゜)つロ 干杯~bilibili
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Doubledyefilling(usingDiOanddi-4ANEPPS)(KristaWilliams)

DyeFilling

  1. Label15mlcentrifuge(c/f)tubeswithstrainname.Squirt~1-2mlM9ontoplatewithaPasteurpipet.RinseplatewithM9usingapasteurpipetandtransfersolutiontoc/ftube.
  2. Spinpulseonhighinaclinicalc/fandcarefullyremovesupernatant(s/n).Wormpelletwillbeveryloose.
  3. WashoncewithM9(optional).
  4. Add2mlM9.
  5. AddDiO(2mg/mlinDMF)at5l/mlofM9.
  6. Adddi-4ANEPPS(1mg/mlinDMF)at8l/mlofM9andcoverthec/ftubeinfoiltoprotectfromlight
  7. Rockthetubefor~1hourat20°Conalabquakerocker.
  8. Afterrocking,spinpulseonhighandremoves/nwithPasteurpipet.
  9. WashoncewithM9
  10. Transferwormpellettolabeledplate(s).Useenoughplatesthatwormshavesufficientfood.
  11. Allowtheplatestositat20°Cfor~20minutesorsufficienttimetopassthedyeoutofthedigestivetract.NOTE:Ifwormsarelefttoolong,thedi-4ANEPPSwillspreadtoallmembranesinwormandmakeaverystrongredbackgroundinwholebody.
Viewing
  1. Makepadsusing5%agarwith10mMNaN3(10lof1MNaN3/mlof5%agar--ourtesttubescontain4mlof5%agar).
  2. Apply4-6lofM9tooneendofthepad.
  3. Transfer25-50wormstotheM9,addingmoreM9ifitstartstoevaporate.
  4. Putcoversliponandviewwithuprightandfluorescence.Phasmidneuronsshouldstaingreen(DiO)andphasmidsocketcellsshouldstainred(di-4ANEPPS).BothstructuresshouldbevisIBLethroughsamefilter.Limitexposureofwormstolight,asdi-4ANEPPSisinactivatedbylight.

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