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Addgene/pAAV-Syn-Chronos-GFP/1unit/59170-AAV5
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Addgene/pAAV-Syn-Chronos-GFP/1unit/59170-AAV5
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Addgene
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59170-AAV5
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ItemCatalog #DescriptionQuantityPrice (USD)
Plasmid59170Standard format: Plasmid sent in bacteria as agar stab1$75
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AAV159170-AAV1Virus (100 µL at titer ≥ 1×10¹³ vg/mL)and Plasmid.More Information
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AAV559170-AAV5Virus (100 µL at titer ≥ 5×10¹² vg/mL)and Plasmid.More Information
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AAV Retrograde59170-AAVrgVirus (100 µL at titer ≥ 7×10¹² vg/mL)and Plasmid.More Information
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This material is available to academics and nonprofits only.

Backbone

  • Vector backbone
    AAV
    (Search Vector Database)
  • Backbone sizew/o insert(bp)4368
  • Total vector size (bp)6078
  • Vector type
    Mammalian Expression, AAV

Growth in Bacteria

  • Bacterial Resistance(s)
    Ampicillin
  • Growth Temperature
    37°C
  • Growth Strain(s)
    NEB Stable
  • Growth instructions
    Stbl3 at 30C (use carbenicillin if using Stbl3) OR DH5a at 37C (use ampicillin if using DH5a)
  • Copy number
    Low Copy

Gene/Insert

  • Gene/Insert name
    Chronos-GFP
  • Alt name
    ChR90-GFP
  • Alt name
    Stigeoclonium helveticum channelrhodopsin
  • Species
    Stigeoclonium helveticum
  • Insert Size (bp)
    1710
  • GenBank ID
    KF992040.1
  • PromoterSyn
  • Tag/ Fusion Protein
    • GFP (C terminal on insert)

Cloning Information

  • Cloning methodRestriction Enzyme
  • 5′ cloning siteBamHI(not destroyed)
  • 3′ cloning siteEcoRI(not destroyed)
  • 5′ sequencing primerCTGCGTATGAGTGCAAG
  • 3′ sequencing primercagcgtatccacatagcg
  • (Common Sequencing Primers)

Resource Information

  • Terms and Licenses
    • UBMTA
    • Ancillary Agreement for Plasmids Containing FP Materials
  • Industry Terms
    • Not Available to Industry
  • Articles Citing this Plasmid
    • 3 References

Depositor Comments

Plasmid is completely sequenced by the depositing lab except for part of the 5' ITR.

Information for AAV1 (Catalog # 59170-AAV1)(Back to top)

Purpose

Ready-to-use AAV1 particles produced from pAAV-Syn-Chronos-GFP (#59170). In addition to the viral particles, you will also receive purified pAAV-Syn-Chronos-GFP plasmid DNA.

Syn-driven Chronos-GFP expression for optogenetic neural activation. These AAV preparations are suitable purity for injection into animals.

Delivery

  • Volume100 µL
  • Titer≥ 1×10¹³ vg/mL
  • Pricing$350 USD for preparation of 100 µL virus + $30 USD for plasmid.
  • StorageStore at -80℃. Thaw just before use and keep on ice.
  • ShipmentViral particles are shipped frozen on dry ice. Plasmid DNA (≥ 200ng) will also be included in the shipment.

Viral Production & Use

  • Packaging Plasmidsencode adenoviral helper sequences and AAV rep gene, AAV1 cap gene
  • BufferPBS + 0.001% Pluronic F-68
  • SerotypeAAV1
  • PurificationIodixanol gradient ultracentrifugation
  • Reporter GeneGFP

Biosafety

Requestor is responsible for compliance withtheir institution"s biosafety regulations.Lentivirus is generally considered BSL-2. AAV isgenerally considered BSL-1, but may requireBSL-2 handling depending on the insert.Biosafety Guide

Resource Information

  • Terms and Licenses
    • Ancillary Agreement for Penn Vectors
    • Terms of Use for Viral Vectors
  • Industry Terms
    • Not Available to Industry

Viral Quality Control

Quality Control:
  • Addgene ensures high quality viral vectors by optimizing and standardizing production protocols and performing rigorous quality control (QC) (see a list of our QC assays). Thespecific QC assays performed varies for each viral lot. To learn which specific QC assays were performed on your lot, please contact us.
  • Titer: the exact titer of your sample will be reported on the tube. The titer you see listed on this page is the guaranteed minimum titer. See how titers are measured.

Visit our viral production page for moreinformation.

Information for AAV5 (Catalog # 59170-AAV5)(Back to top)

Purpose

Ready-to-use AAV5 particles produced from pAAV-Syn-Chronos-GFP (#59170). In addition to the viral particles, you will also receive purified pAAV-Syn-Chronos-GFP plasmid DNA.

Syn-driven Chronos-GFP expression for optogenetic neural activation. These AAV preparations are suitable purity for injection into animals.

Delivery

  • Volume100 µL
  • Titer≥ 5×10¹² vg/mL
  • Pricing$350 USD for preparation of 100 µL virus + $30 USD for plasmid.
  • StorageStore at -80℃. Thaw just before use and keep on ice.
  • ShipmentViral particles are shipped frozen on dry ice. Plasmid DNA (≥ 200ng) will also be included in the shipment.

Viral Production & Use

  • Packaging Plasmidsencode adenoviral helper sequences and AAV rep gene, AAV5 cap gene
  • BufferPBS + 0.001% Pluronic F-68 + 200 mM NaCl
  • SerotypeAAV5
  • PurificationIodixanol gradient ultracentrifugation
  • Reporter GeneGFP

Biosafety

Requestor is responsible for compliance withtheir institution"s biosafety regulations.Lentivirus is generally considered BSL-2. AAV isgenerally considered BSL-1, but may requireBSL-2 handling depending on the insert.Biosafety Guide

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  • Terms and Licenses
    • Terms of Use for Viral Vectors
  • Industry Terms
    • Not Available to Industry

Viral Quality Control

Quality Control:
  • Addgene ensures high quality viral vectors by optimizing and standardizing production protocols and performing rigorous quality control (QC) (see a list of our QC assays). Thespecific QC assays performed varies for each viral lot. To learn which specific QC assays were performed on your lot, please contact us.
  • Titer: the exact titer of your sample will be reported on the tube. The titer you see listed on this page is the guaranteed minimum titer. See how titers are measured.

Visit our viral production page for moreinformation.

Information for AAV Retrograde (Catalog # 59170-AAVrg)(Back to top)

Purpose

Ready-to-use AAV Retrograde particles produced from pAAV-Syn-Chronos-GFP (#59170). In addition to the viral particles, you will also receive purified pAAV-Syn-Chronos-GFP plasmid DNA.

Chronos-GFP under the control of the Synapsin promoter. These AAV were produced with a retrograde serotype, which permits retrograde access to projection neurons. These AAV preparations are suitable purity for injection into animals.

Delivery

  • Volume100 µL
  • Titer≥ 7×10¹² vg/mL
  • Pricing$350 USD for preparation of 100 µL virus + $30 USD for plasmid.
  • StorageStore at -80℃. Thaw just before use and keep on ice.
  • ShipmentViral particles are shipped frozen on dry ice. Plasmid DNA (≥ 200ng) will also be included in the shipment.

Viral Production & Use

  • Packaging Plasmidsencode adenoviral helper sequences and AAV rep gene, AAV retrograde cap gene from rAAV2-retro helper (plasmid #81070)
  • BufferPBS + 0.001% Pluronic F-68 + 200 mM NaCl
  • SerotypeAAV retrograde (AAVrg)
  • PurificationIodixanol gradient ultracentrifugation
  • Reporter GeneGFP

Biosafety

Requestor is responsible for compliance withtheir institution"s biosafety regulations.Lentivirus is generally considered BSL-2. AAV isgenerally considered BSL-1, but may requireBSL-2 handling depending on the insert.Biosafety Guide

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  • Terms and Licenses
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  • Industry Terms
    • Not Available to Industry

Viral Quality Control

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  • Addgene ensures high quality viral vectors by optimizing and standardizing production protocols and performing rigorous quality control (QC) (see a list of our QC assays). Thespecific QC assays performed varies for each viral lot. To learn which specific QC assays were performed on your lot, please contact us.
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Reagents Heparin - 1000 U/ml Ficoll-Hypaque PBS RPMI-1640 supplemented with 10 mM glutamine and 15% FBS AET (0.14M) Dissolve 1.967 g AET in 35 ml di-H2O. Adjus 查看更多>
Fixation and Staining ParametersAntigen Fixation Fixation time AntibodyDilutionRefmicrotubules 100% MeOH 5 min @ RT DM1a1:500actin 4% Formaldehyde* 8 min @ RT 查看更多>
Purification of Gene Targeting Vector DNA for Electroporation1. Purify plasmid from bacteria.We recommend the Qiagen EndoFree Plasmid Maxi kit for the purifica 查看更多>
Materials Needed20ml glass scintillation vial Small stir bar Foil Glycerol 1X PBS Pipets * P-phenylenediamine ( EMD Chemicals Inc. Cat# PX0730) Carbonate-Bicar 查看更多>
Yeast IF with Methanol/Acetone DehydrationDavid AmbergNote this protocol is a modified version of the protocol from Mark Rose in the CSH Yeast Genetics Course 查看更多>
EM Fixation of EmbryosAdapted following advice from Andy Fire and Jim Priess1. Mount embryos on slides as if for DIC, except agar has fixative. Agarose Fixativ 查看更多>
RNA Whole Mount In Situ HybridizationCore protocol for both mouse and chick embryos Cepko/Tabin lab Embryo preparationFix embryos in fresh 4% paraformaldehyde 查看更多>
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STAINING NONFILAMENTOUS ACTIN WITH VITAMIN-D BINDING PROTEINMaterials1. Gc-globulin (vitamin-D binding protein; Calbiochem 345802), prepare 2 mg/ml stock in PB 查看更多>
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荧光染料是研究生物学围观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一,楼主想要详细的了解的话,可以去专业的网站上面找找看,有空的话可以去生物帮那里查看一下。我比较喜欢去那里查找资料的。这个网站蛮专业的。我记得上面有一个介绍了分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料文档,还对荧光染料的使用提出了自己的看法。你可以参考一下啊。有时间就去那儿上面( YINGG.www.bio1000.com/ )找找看啊,希望可以帮到你啊
染料有lucifer!Gfp rfp 地高辛标记的碱性磷酸酶
溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合,进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加,作为补偿,将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后,超螺旋度大为增加, 从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限,可继续结合更多溴化乙锭,直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别,线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时,为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁,但其中最好的方法,也应是聚乙二醇分级沉淀法。
从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多,其分离的依据可利用分子大小不同,碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。碱基性法抽提效果良好,既经济且得率较高。抽提到的质量DNA可用于酶切、连接和转化。对于分子量较大拷贝较少对的质粒DNA,由于DNA片段较大易于损伤断裂,因此选用吕华铯密度超高离心法抽提DNA,且具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质量DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒,用少量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于基因操作。

质粒DNA纯化的试验步骤:
测量DNA溶液的体积,按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。
每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液(10mg/ml溶于水);立即将溴化乙锭溶液(漂浮在表层)与DNA-氯化铯溶液混匀, 溶液的终密度应为1.55g/ml(溶液的折射率为1.3860)溴化乙锭浓度大约740μg/ml。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内(如用锡箔完全包裹的瓶子),于室温保存。
室温下用Sorvall SS34头(或与其相当的转头)以8000rpm离心5min, 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。
用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到离心管中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。
以20℃对所得的密度梯度以45 000rpm离心16h(VTi65 转头)、 以45 000rpm离心48h(Ti50转头)、以60 000rpm离心24h(Ti65转头)或者以60 000rpm离心24h(Ti70.1转头)。普通光照下,在梯中心可见两条DNA区带, 上部区带材料通常较少,由线状的细菌(染色体)DNA和带切口的环状质粒DNA组成:下部区带则由闭环质粒DNA组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭RNA复合物,位于CsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。Beckman Quick-Seal离心管中的CsCl-溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒DNA而不至超负荷。如有更大量的质粒存在,将扩展为一条宽带,并与染色体DNA相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现,只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现负荷,可收集整个DNA区高产水平时才会出现,只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现超负荷,可收集整个DNA区带,用CsCl溶液(ρ=1.58g/ml)将体积调到15ml,在两个离心管中再度离心,使DNA达到平衡。
收集DNA带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入,为尽量减少污染的机会,首先用18号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带(杂色体DNA):用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂,然后将一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将18号皮下注身针头(其斜面向上)插入管中,以便使针头的斜面开口恰好位于染色体DNA区带之下并与该区带相平行。将粘稠状DNA收集到一次性使用的管内,用造型粘土块封住皮下注射针头的末端并将第2根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第3根皮下注射针头(18号),将下部的质粒DNA区带收集到玻璃或塑料管中。展开
1.无Ct值出现
  检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
  引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。
  模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
  模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
  2.Ct值出现过晚(Ct>38)
  扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
  PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
  PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。
  3.标准曲线线性关系不佳
  加样存在误差:使得标准品不呈梯度。
  标准品出现降解:应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。
  引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。
  模板中存在抑制物,或模板浓度过高
  4.负对照有信号
  引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
  引物浓度不佳:重庆新桥医院网上预约挂号www.cqxqyy.net适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
  镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒
  模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。
  5.溶解曲线不止一个主峰
  引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
  引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
  镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。
  模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。
  6.扩增效率低
  反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
  反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
  反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。
  7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线,如何判断?
  判断标准:扩增效率,灵敏度,特异性
  如果扩增效率在90%-110%,都是特异性扩增,都可以把数据用于分析。
  8.扩增曲线的异常?比如“S”型曲线?
  参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时,选NONE)
  模板的浓度太高或者降解
  荧光染料的降解
荧光染料按照化学架构分属于什么染料
这些染料的结构式基本是保密的。有些地方能查到,象维基上就有SYBR Green的结果式,但谁也不能肯定是否是正确的。
没图片
既说像坐标画曲线曲线应纵轴该荧光强度吧轴数值变化代表荧光强度变化荧光强度变化代表钙离浓度变化 我觉直接用荧光强度值变化代替钙离浓度变化研究意义该钙离浓度变化吧

非要荧光强度值换算钙离浓度需要做列工作
1 取标准钙离浓度染色用共聚焦显微镜测荧光强度
2 标准品需要同像环境主要曝光间相同激光波及能量
3 标准品要用同浓度荧光染料
才能根据标准荧光强度关系推算品钙离浓度
想问一下各位大侠提质粒时用的是那个公司的试剂盒呀?我的扩增荧光增量一直不是很高,而且作为被动参比的ROX信号比FAM的基线部分高很多,不知是不是质粒的质量不好造成的。
所以想请大家给推荐一个效果好的最好是国产的质粒提取试剂盒。
多谢!
请教各位高手,荧光分光光度法测物质的含量是否必须绘制标准曲线?如果不做标准曲线,能不能用Beer定律一类的公式来计算物质的相对含量?请做过荧光分光光度法的高手指点一下,如果有这方面的操作说明,尤其是如何计算待检物质含量的例子,能否说一下,先谢谢了。邮箱wzhnanhua@eyou.com
普通的节能灯,日光灯发出的光各种波长都有,波长范围很宽。激光单色性很好,波长范围很窄,波长650nm指的是这种激光笔发出的光波长在650nm附近很窄的范围里。可见光的波长范围在390—770纳米之间。红:770—622nm;橙:622—597nm;黄:597—577nm;绿:577—492nm;蓝靛:492—455nm;紫:455—390nm。650nm应该是红光。所以是红色光的激光笔。
对不同材料来说不同,绝大多数情况下,发射波长会随着激发波长的偏移而有所偏移。 对于固态物质,主要是因为分子与其它材料形成了π建 对于量子点溶液,激发波长也会显著导致发射光谱的不同。但是不是绝对的,比如对于Alex555分子,发射波长的便宜往往就相对较小,这是由于分子内部的能带结构所决定的。 如果是单纯的回答问题,答案是:有关。
快到年关,才准备要做实时定量,但因从没做过,万一设计有误,那损失不堪设想,恳请各位高手帮我看看有没有什么问题:
我要检测的是一个巢氏PCR的终产物,那我能否用首次PCR的产物纯化,稀释后来作标准品?好象一般都认为用质粒作更好,但我想质粒片段与我样品首次PCR产物的长度不同,扩增效率是不是也有差异?而且用质粒扩增前,是不是要先把质粒酶切成线性后,才能扩?(这个问题好象有点菜)
另外,如果用荧光染料,那是用预混型试剂好,还是各配各的好?因为据说镁离子浓度对实验影响较大,如果用预混型,不是就不能调离子浓度了吗?

先谢谢各位了。
各位好!
附件中是我的标准曲线结果,标准品按照10x稀释,荧光染料是SYBR,可是在荧光强度与CT值的关系图中,曲线间的行距还可以接受,但是在LOG荧光值与CT值的关系曲线中,曲线怎么那么难看呢?为什么他们之间的行距不是相等的呢?我以前做的曲线很漂亮的,这是什么原因呢?影响定量的结果吗?并且在样品中也出现这么难看的曲线,就是指数增长期曲线不平滑,是什么原因呢?

切盼高手指点!!!

standardcurve.doc(49.0k)
一般情况,不管荧光染料还是其他染料,只要不是活性染料和还原染料,基本上都不存在失效问题。
你的荧光染料具体是哪一种?你可以通过染色试验来决定是否有效啊?一般荧光染料染色后,都会呈现明亮的颜色,比一般同样颜色要亮的多。只要能染上、只要有亮度,就是没失效。
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