一材料与设备

1)限制性内切核酸酶

2)模板DNA或质粒

3)TE

4)TE饱和酚：氯仿

5)氯仿：异丙醇(24:1)

6)3mol/LNaAc(pH5.2)

7)无水乙醇

8)5×转录缓冲液：200mmol/LTris-HCl(PH7.9),300mmol/LMgCl₂,10mmol/L亚精胺，50mmOl/LNaCl

9)l00mmol/LDTT

10)RNasin

11)rATP，rGTP,rUTP,各2.5mmol/L

12)[α⁴²P]rCTP(50uCi,10uCi/ul)(lCi=3.7X1010Bq)

13)SPG,T3或T7RNA聚合酶

14)TE-饱和的酚：氯仿：异戊醇(25：24:l，pH4.5)

15)DNase

16)7.5mol/L乙酸铵

17)无水乙醇

18)70%乙醇

19)DE81膜

20)0.5moJ/LNa₂HPO₄₍pH7,0)

21)液闪仪

22)琼脂糖

23)电泳槽

24)离心机


二操作方法

1.制备DNA模板

1)确定克隆位点内或其下游的限制性酶切位点，产生预期的失控转录物（run-offtranscript)。尽可能选择产生5＇突出或黏性末端的限制酶。如果用的酶产生了3＇突出端，可以换用其他酶，或补平。

2)通过琼脂糖凝胶电泳检查消化的完成情况。此时将DNA样品置于冰上，如果消化完全则继续下一步，否则，再加限制性内切核酸酶至DNA中，反应30min，再进行电泳分析。要注意酶不能超过总体积的10%，因为酶保存在甘油中，过量的话会影响酶活力。

3)加入等体积TE饱和酚；氯仿，混旋1min抽提DNA，12000g离心2min,转移上层液相至一新管中，加1倍体积的氯仿：异丙醇（24:1）混旋lmin,12000g离心2min。

4)转移上层液相至一新管中，加0.1倍体积的3mol/LNaAc(PH5.2)，2倍体积的无水乙醉沉淀DNA，、-70℃放置30min，12000g离心2min

5)小心倒掉上清，用1ml70%乙醇冼沉淀，12000g离心2min,吸弃上清，真空干燥沉淀，然后用无菌水或TE缓冲液重悬DNA样品至浓度约为lmg/ml。

2.体外转录反应

体外转录体系一般需要加入同位素标记以增强检测的灵敏度。RNA转录可以用³²P-，³³P-³⁵S-或¹H-标记核糖核苷酸，在4种核苷酸中，只有rCTP和rUTP用于同位素标记。表3.2给出了常用的标记核苷酸的特异性。



下面以使用「α³²P」rCTP为例，说明体外转录体系的操作程序如下.

1)按顺序依次加入：

5X转录缓冲液                        4ul

DTT,100mmol/L                                             2ul

RNasin                                                      20-40U

rATP,rGTP,rUTP(各2.5mmnol/L)                      4ul

线性模板DNA(0.2〜1mg/ml)                          1ul

(a-32P)rCTP(50uCi,10uCi/ul)                             5ul

SP6,T3或T7RNA聚合酶               15〜20U

加无RNase的水至终体积为                          20ul


上述组分需在室温下混合，若在操作，缓冲液中的亚精胺会使DNA发生沉淀。

2)于37〜40℃反应lh,

3)取出1ul测定同位素掺入效率，剩余的样品可用无RNase的DNase消化。

3.转录RNA产物纯化

体外转录反应完后，应用DNA酶I可以把DNA模板切除去，这样可以获得高敏感性的RNA探针。具有生物活性的RNA样品也要求去除DNA模板，这时保持RNA的完整性是关键的，故DNase为不含RNA酶的DNA酶，它可以有效地去除DNA而维持新合成的RNA的完整性。

1)在体外转录体系内加入DNA酶，终浓度为1U/ug模板DNA。

2)于37℃孵育15min

3)用TE-饱和的酚：氯仿：异戊醇（25:24:l,pH4.5)抽提蛋白.涡旋振荡lmin,12000g离心

4)将上层水相转移到新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），涡旋振荡lmin,12000g离心

5)将上层水相转移到新的离心管中，可以取少量进行变性胶电泳分析，剩佘的进一步沉淀回收

4.沉淀回收转录RNA产物

1)加入0.5倍体积的7,5mol/L乙酸铵。

2)加2.5倍体积的无水乙醇，混合后置于一70℃30mim。

3)12000g离心5min，小心去除清。

4)沉淀用1ml70%的乙醇洗涤，干燥，然后溶于10〜20ul的TE缓冲液或水中，存于一70℃。

5.确定RNA转录产物中同位素的掺入比例和RNA探针的特异活性

1)用19ul无核酸酶的水稀释标记好的探针，取稀释好的样品3ul点至4张DE81膜上，室温或灯下使膜干燥。

2)直接放两张膜到分开的闪烁瓶中，加入闪烁液并计数。计算每张膜的平均cpm(每分钟计数)值，按下面公式确定起始反应中每微升的cpm值：

起始反应的总cpm/ul=每张膜的平均cptnX(20倍稀释/3ul)

3)从剩余的两张膜上洗去未结合的核苷酸，用50〜100ml,0.5mol/LNa₂HPO₄₍pH7.0)洗三次，沥干水分后放至70%乙醇中，取出，室温或灯下干燥。

4)把膜放入闪烁瓶后，加入闪烁液计数。计算起始反应中每微升结合到RNA上的cpm值：

起始反应中结合的cpm/ul=每张膜的平均cpmX(20倍稀释/3ul)

此公式也适用于估计同位素标记的RNA探针的特异活性.

5)由步骤2)和4)计算结合百分数。

结合百分数=(结合的cpm/总cpm)X100%

按这种方法算出的结合率通常在70％〜100%,放射性标记核苷酸结合率低如低于50%)表明RNA合成效率较低。

6)以cpm/ugRNA合成的量计算探针的特异活性。这时要首先计算总的结合Cpm

总结合cpm=(结合的cpm/ul)X20ul反应体积

下一步需要计箅反应中核苷酸的总纳摩尔数，用来确定有多少毫克RNA合成；
50uCi[α³²)CTP(400uCi/nmol)相当于0.121nmol³²P-CTP/反应。加12umol/L未标记CTP(0.24nmOl)至CTP达到0.36nmol,如果获得最大的100%结合，那么RNA转录产物或标记RNA探針中CTP就代表了1/4的核苷酸，探针中核苷酸结合总量应为（0.36nmolX4)或1.44nmol,估计核苷酸的平均分子质量为330Da，那么样品中RNA合成的量为1.44nmolX(330ng/nmol)—475ng。如果从步骤5)算出的结合率为80%，那么实际反应中合成的量为475ngX0.80=380ng。

                SA=总结合cpm/ugRNA

在这个例子中，SA就等于总结合cpm除以0.380ug

6.阳性对照设立与电泳分析

需要设立阳性对照以检测所用试剂.和操作步骤是否规范。一般商品化的体外转录试剂盒都带有阳性对照质粒模板。反应体系和样品绀类似，只需将模板更换并不需加入同位素标记的核苷酸。Promega公司的RiboProbe体外转录体系提供的阳性对照质粒含有T7、T3和SP6等3个启动子，使用不同的RNA聚合酶，可以转录得到不同大小的转录产物。

RNA电泳时，使用含冇0.5ug/ml溴化乙锭的TAE缓冲液制备琼脂糖凝胶或聚丙_烯酰胺凝胶均可。变性胶（含甲醛，乙二醛或8mol/L的尿素）可以用于分离变性的RNA，而用非变性胶分离在甲醛/甲酰胺RNA样品缓冲液中变性的RNA也町以得到不错的结果。