无形体核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)使用说明书上海邦景实业...
| 试剂、试剂盒 | 磷酸盐缓冲溶液硫氰酸胍溶液CsClTES缓冲液乙酸钠缓冲液无水乙醇经DEFC处理的水。 仪器、耗材 | 离心机注射器及20W针头 实验步骤 | 一材料与设备 1)磷酸盐缓冲溶液(PBS) 2)硫氰酸胍溶液：4mol/L硫氰酸胍，0.lmmol/LTris-HClpH7.5，1%β-巯基乙醇 3)CsCl5.7mol/：L(DEPC处理） 4)TES缓冲液:0.1%SDS，10mmol/LTris-ClpH7.4，lmmol/LEDTA 5)3mmol/L乙酸钠缓冲液(PH5.2，DEPC处理） 6)无水乙醇 7)经DEFC处理的水 8)离心机 9)6ml注射器及20W针头 二操作方法 1.单层培养细胞 1)室温下用PBS洗涤细胞，每平皿5ml洗涤2次。 2)在不超过105个细胞中加人3.5ml硫氰酸胍溶液，使之遍布整个平皿。用橡胶细胞刮于擦刮平皿，回收黏稠的细胞裂解液，用装有20-G针头的注射器往返抽吸裂解物，舍并在一起 2.悬浮培养细胞 1)离心回收≤l08个细胞，用相当于1/2原有体积的PBS重悬之，并再次离心回收细胞。 2)往离心管中加人3.5ml硫氰酸胍溶液。 3)用装有20-G针头的6ml注射器将黏稠的细胞裂解液往返抽吸4次，并将其移至一个干净的试管中。本步骤的重要性在于可对染色体DNA进行剪切，以降低溶液的黏度， 4)在经硅化井高压过的13mmX51mm的超速离心管中，加人1.5ml5.7mol/LCsCl并在CsCl层加人3.5ml细胞裂解液，界面应保持清晰。1)〜4)步的操作均在室温进行。 5)于18℃，150000g离心12〜20h(缓慢加速和减速） 6)用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子随液面的下降而下降。当吸至仅剩约100ul时，小心倒置管子,倒出剩余液体在界面处应有一白色的DNA带，必须仔细地完全移去此带，因为它含有染色体DNA。 7)晾于沉淀约5〜lOmin，然后以360ulTES溶液重溶沉淀，反复用吸管上下抽吸，如此在室温逬行5〜l0min，转移溶液于另一干净的微量离心管。 8)加人40u13mol/LpH5.2的乙酸钠缓冲液和1ml无水乙醇，在干冰/乙醇中沉淀30mim，离心10〜15min,用360ul水重溶沉淀并重复沉淀过程。 9)沉淀晾干l0min,溶解于20ul水中，取10ul稀释至lml，测A260和A280.最后，以水溶液或乙醇沉淀的形式在一70℃储存RNA。 注意事项 | 1)要用足够的时间去重溶沉淀，否则RNA的产量会有显著下降。 2)小RNA在CsCl中离心时不能有效地沉淀，因此不能用此方法制备5SRNA和tRNA等分子。 3)乙醇可以洗去沉淀中的氯化铯.使沉淀易于溶解 |
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发布于 ： 2018-08-10
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