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| 实验材料 | 大肠杆菌 试剂、试剂盒 | LBTEM13聚乙二醇容易让顶层琼脂乙酸钠乙醇 仪器、耗材 | 巴斯德吸管试管离心机 实验步骤 | 1. 如果起始用M13复制型DNA或M13单链DNA，以0.5ng重组M13mp复制型DNA或5~10ng单链DNA转化40μl 感受态大肠杆菌DH5αF"株，按热休克方案进行转化。 2. 转化细胞加0.2ml大肠杆菌DH5αF"过夜培养物后，混匀于3mlH顶层琼脂，倾倒于37℃平板，倒扣后置于37℃过夜。 3. 大肠杆菌DH5αF"过夜培养物以2×TY培养液稀释100倍，分装于18mm×150mm试管，每份1.5ml。 4. 用无菌巴斯吸管挑取M13mp噬斑，并置于上述每份培养物中，要注意确保琼脂块已玻转移。 5. 重复进行挑斑，在37℃生长细菌5~6 h。 6. 细菌培养物移至1.5ml微量离心管中，于4℃或室温高速离心5min，上清移至一个干净的1.5ml微量离心管中。 7. 噬菌体上清加入200μlM13PEG溶液，混匀，于室温放置15min，高速离心5min，弃上清。 8. 高速离心30s，并以头部已拉细的巴斯德吸管吸出残余液体。 9. 以100μlTE重悬沉淀，加入100μl缓冲液平衡酚，旋涡混合器轻轻振荡15~20s。 10. 于4℃或室温高速离心5min，转移上上清水相于一个干净的微量离心管中。 11. 加入11μl3mol/lpH5.2的乙酸钠和250μl100%乙醇，于-70℃冷冻20min。 12. 4℃高速离心10min，弃上清。 13. 加入100μl冰冷70%乙醇，微量离心，弃上清，重复此70%乙醇冼涤1次。 14. 在Speedvac真空旋转蒸犮器中干燥沉淀。 15. 沉淀重溶于20μl缓冲液，取0.5μl在小型凝胶中电泳，以确证DNA的浓度。 16. 剩余贮于-20℃直到用作模板进行测序反应。 |
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发布于 ： 2018-08-05
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