1.从配有181/2G针头的10ml注射器中滴入外周血（18~25滴；0.4~0.5ml)至已盛有10mlRPMI/15%FBS完全培养基的25cm2组织培养瓶中。配置两份培养基为DEB研究，两份作为未处理对照（共4份）。孵化培养基24h(附录31)。

2.分装PBS至3个15ml离心管中：第1管10ml，第2管6ml，第3管4.5ml。

3.在加培养基之前，先加10ul常用的DEB至第1管，加盖，混匀。从第1管中转移4ml至第2管，加盖，混匀。从第2管中转移0.5ml(500ul)至第3管，加盖，混勻。

4.从第3管中各取25u1溶液加入两个已孵化了24h的外周血培养基中（从第1步；培养瓶中的最终浓度为0.lug/ml。）。再孵化48~72h。

5.每10ml培养基中各加人1ul/ml的秋水仙胺2ml，孵化20min。

6.将每个培养基培养瓶中的液体转移到15ml圆锥形底部的离心管中，加盖，150g离心10min。

7.去掉大部分上清液，用手指轻弹离心管，使剩余上清中的片状沉淀物重新处于悬浮状态，小心地加人预热的0.075mol/LKa5ml，使细胞膨胀，但不要使其破裂。在37°C水浴槽中孵化10min。室温，150g离心10min。

8.去掉上清，轻轻地加入1ml新鲜的固定剂，不要把沉淀冲起来。去掉固定剂，重复这一步。

9.立即用食指弹击管壁几次，使片状沉淀物碎裂。迅速加入固定剂使细胞悬浮，防止其成块。终体积为8~10ml。用Pasteur移液管打散团块。室温静置30min。

10.室温，150g离心lOmin。去掉上清，留下3~5ml，使片状沉淀物悬浮。室温静置lOmin。可立即重复这一步一次或两次，也可以让固定剂中的细胞在室温下过夜以后进行。

11.室温，150g离心lOmin。去掉上清，打散沉淀，加入适量的固定剂（0.25~0.5ml)，使其达到一个理想的浓度用于制片。

一个理想的细胞浓度能使绝大部分细胞在一个显微视野中，没有拥挤的中期伸展。

12.从一个适当的高度，滴下几滴细胞悬液于清洁的玻片上，使中期分裂相能很好地散布（单元4.1)，一瓶培养基最少要制作6块玻片（推荐使用非诊断用的细胞去练习)。

这一步是成功的关键。

13.在倒置显微镜下观测玻片，确定中期分裂相的质量和数量。用吉姆萨将玻片染色(支持方案2)。

14.每一个DEB处理的标本分析50~100个用吉姆萨染色的中期分裂相（对于高度断裂的情况分析25个中期分裂相；附录3K)。对染色体进行计数，并记录结构异常的染色体的数目和类型。如果断裂的染色体超过了上面的正常范围，分析未处理的标本。分析完成后对异常的细胞进行照相。

15.根据已出版的结果作为基础和PHA刺激下，夕卜周血淋巴细胞中DEB诱导染色体断裂情况下解释结果。

表8.7.1显示了从正常和受影响的个体中得到的基线和处理培养数据

支持方案1二氧桥丁烷的使用和处理

DEB(1，3-双环氧丁烷）为潜在的致癌物质，处理这种化合物时，必须采取一些防范措施。这一部分阐述的是如何使用和恰当地处理废物。

工作空间。凡用到DEB的操作必须在化学通风橱或者n级生物学安全工作橱中完成。在使用DEB时要穿实验工作服和戴手套。手上随时准备一瓶6mol/LHCl(50ml)，一旦DEB不小心倒出来马上将其灭活。

细胞培养。有DEB参与的细胞培养操作应该在n级生物学安全工作橱中完成。细胞被固定后，操作就可以在安全橱外进行了。用6mol/LHCl处理废弃的培养基和清洗液，并视其为危险生物废物。以前使用过的移液管和培养瓶应该用6mol/LHCl冲洗，并放在高压危险生物袋中。微量移液吸头也应该丢在盛有6mol/LHCl的小瓶内。

废物处理。DEB原液应该当作危险的化学废物来处理，而不能采用稀释或化学灭活的方法。使用过的塑料器具应该用6md/LHCl冲洗并丢入高压危险生物袋中。培养基和清洗液也应该用6mol/LHCl处理，并作为危险生物废物来处置。

支持方案2用于染色体断裂分析的吉姆萨染色

吉姆萨染色是一种组织学染色，对细胞核和染色体有特别的亲和力。制作简单，使未显带的细胞核和染色体成微红色到紫色。

1.将一片pH6.8的Gurrs缓冲液溶于1L水中。

2.加入4ml新鲜的吉姆萨染液至盛有46mlGunrs缓冲液的染缸中。染液可使用1h或染20块玻片，然后就要配置新的染液。

3.将中期染色体玻片染色5min。在盛有Gurrs缓冲液的染缸中浸洗几次（第1步)。

4.在盛有水的染缸中浸洗几次。空气中干燥，检查玻片的染色强度。

染色强度应该足量，而染色体上的裂痕和断裂区又不易染色（非染色）。

5.使用Permount组织封固剂将盖玻片加载于载玻片上。

备选方案1成纤维细胞培养二氧桥丁烷试验

如果外周血不能获取，可以通过皮肤组织活检成纤维细胞培养来进行试验。也可以从流产儿或死产儿中取几小片肺组织或皮肤来进行试验。因为较高浓度对FA成纤维细胞有太大的毒性，很难收获足够多的中期分裂相来进行研究。

1.将0.5mlDMEM完全培养基/20%FBS溶液中的活体组织放于一块60mm组织培养皿上，并用无菌手术刀将其切割成片，1mm大小。

2.另取最少三块60mm组织培养皿，用无菌手术刀尖在皿底划上几条水平线和垂直线。滴几滴DMEM完全培养基/20%FBS溶液至活体组织片上。在每个60mm组织培养皿上用无菌Pasteur移液管放上5或6片活体组织。将组织放在水平线和垂直线的交叉点上。

3.孵化培养皿，不要加任何其他组织培养基，15~30min，使组织片黏附在皿上。加5mlDMEM完全培养基/20%FBS溶液至每块培养皿中，孵化培养基。

4.每3~4d更换一次培养基，但不要扰乱组织片。使用倒置显微镜观察培养基中细胞的生长状况（得花上1周至1月才能观察到生长较好的细胞）。

5.当培养皿中的组织片周围能看到大片的成纤维细胞时，用1X胰岛素/EDTA/15%FBS处理细胞，进行传代（附录31)，注意当活体组织能够继续在培养基中生长时不要将它们取出来。将细胞转移至盛有DMEM完全培养基/15%FBS的25cm²无菌组织培养瓶内。

6.当第一代细胞长满后，再次用胰蛋白酶处理（附录幻）。次代培养按1：3分装至DMEM完全培养基/15%FBS溶液中。为FA患者进行DEB试验时，至少有两个第二代培养基中长满细胞。

7.用5mlDMEM完全培养基/15%FBS溶液将细胞接种在25cm2培养瓶中，使每个培养瓶中细胞的密度达到3X105个细胞（为本次检验准备两个处理的和未处理的对照培养瓶）。孵化24h。

8.将DEB按以前所描述的那样稀释（基本方案，第2~3步），再增加第4管，分装PBS4.5ml。成纤维细胞培养还要增加最后一步稀释，即从第3管中取出0.5ml(500ul加入第4管中。

9.从第4管取出254加入到10ml新鲜的DMEM完全培养基/15%FBS溶液中。

10.培养细胞直至细胞接近长满（约72h)。

11.胰酶消化细胞（附录31)按1:2或1:3传代到新鲜的完全DMEM/15%FBS培养基。该培养基不含DEB用于收集充足的有丝分裂细胞来进行细胞遗传研究。重新加入限制性培养基，该培养基含有鲜好、稀释的DEB。

12.于第一个有丝分裂时段收集培养的细胞（传代24~48h;这时细胞处于有丝分裂中期附近），在收集细胞前3h，加入1ml浓度为1ug/ml的秋水仙胺到DEB处理的细胞中，同时用未用DEB处理的细胞作对照（于5ml培养基）。

13.用胰酶消化细胞，将培养瓶内的液体转移至15ml无菌的离心管，加盖，150g离心10min。

14.去掉大部分上清，使剩余上清内的沉淀重新悬浮，并慢慢加入0.051mol/L的KCl5ml。在37°C水浴箱中孵化lOmin。离心lOmin。

15.像前面叙述的那样将细胞固定在预备好的载玻片上（基本方案，第9~12步；在第9步，缓慢加人3~5ml固定液)。

16.检验100个未处理和DEB处理后吉姆萨染色的中期分裂相细胞，找断裂染色体，方法如前所述（基本方案，第13步，支持方案2)。根据在FA患者成纤维细胞中为基线和DEB诱导的染色体断裂所建立的评估来解释结果。

备选方案2范可尼贫血二氧桥丁烷产前诊断试验

FA可以在妊娠时诊断，但有一定风险，在怀孕9~12周时通过培养绒毛绒膜取样(chorionicvillussampling,CVS)获得滋养层细胞或者在15~17周时羊膜穿刺获得羊水细胞进行研究。FA也可以用胎儿血液进行产前诊断，方法与以前的外周血培养相同。

研究CVS或羊膜穿刺获得的胎儿细胞

1.在25cm²的培养瓶内配置胎儿细胞培养基（单元8.1和单元8.2)。

2.当培养瓶内有几个大的、生长迅速的克隆时，不要让克隆过度的生长，用胰酶消化细胞，按1:2或1:3进行首次传代培养（附录31)。孵化24h。

3.用自有0.01ug/mlDEB的新鲜生长培养基置换生长培养基（从两个不同的首次传代培养基中）至最少两个培养瓶中。可能的话，用含0.1ug/mlDEB的培养基置换首次传代的培养基至另外两个培养瓶中，稀释与以前相同（备选方案丨，第8~9步)。

剩余培养瓶中的液体作为染色体断裂研究基线的未处理对照。

4.孵化培养基，收获并固定细胞，如之前叙述的那样准备中期染色体涂片（备选方案1，从第10步开始)。

5.每组共检测100个中期分裂相（基线组，DEB处理组；每组分别从两个首次传代培养瓶中各取50个中期分裂相）。根据针对通过CVS或羊膜穿刺获得的FA胎儿细胞所制定的基线和DEB诱导的染色体断裂所建立起来的评估来解释结果。