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Worm PCR 实验方法
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WormPCR

  1. Pickonewormandplaceitina2.5ldropoflysisbufferinthecapofaPCRtube.Closeandcentrifugebrieflytomovetothebottomofthetube.
  2. Freezethetubesat-70°Cfor15min.Theideaistodoafreeze-cracktohelpliberatetheDNA.Checkthatthesolutionactuallyfreezes.
  3. Overlaywithadropofmineraloilandincubateat60°Cfor60minutes,followedby95°Cfor15minutes.
  4. Coolto4°C.Pipette22.5lofPCRmastermixontothetopofthemineraloiloverlay.Setsampleinicebucketuntilallsampleshavebeenprepared.
  5. Microfugebrieflytomovethemastermixthroughthemineraloiloverlay.Rapidlyheatthesamplesto94°Candcycle30timesthroughaprogramappropriateforthetemplateDNAandtheprimersyouareusinginthereaction:
    • Meltingstep:94°Cfor30sec(standard)
    • Annealingstep:~5°Cbelowmeltingpt.oftheprimersandusuallyheldforbetween30secondsand1min.
    • Extensionstep:72°Cstandardtemp.andest.timebasedonlengthoftemplate(approx.1minper1kb)
  6. Analyze10mlofeachsampleona3.0%Metaphoragarosegel,ora6%acrylamidegel.BesuretorunStyIorsomeothermolecularweightMarker.
Lysisbuffer(storeonthebenchtopwithoutproteinaseK).
  • 60g/mlproteinaseK
  • 10mMTris-Cl,pH8.2
  • 50mMKCl
  • 2.5mMMgCl2
  • 0.45%Tween-20
  • 0.05%gelatin
Mastermix.Prepareamastermixcontainingthefollowingamountsofeachcomponentperreaction.Makeenoughmastermixfor(n+1)reactions.
  • 2.5l10Xamplificationbuffer
  • 2.5l2mMdNTPs
  • 1.5l25mMMgCl2
  • 0.12l5U/lTaqpolymerase(0.6Units/reaction)
  • 1.25lprimermix(20pMol/lconc.ofprimercombination)
  • 14.63ldH2O

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发布于 ： 2018-12-26 阅读（178）
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