The2-AAlabelingkitcontainstwosetsofthefollowingreagents(15samplesperkit)suppliedinglassampoulessealedunderpurenitrogen: 2-aminobenzoicacid(2-AAdye) Dimethylsulfoxide(DMSO) Aceticacid Sodiumcyanoborohydrideor2-picolineborane
TrADItional2-ABand2-AAlabellingkitsusesodiumcyanoborohydrideasareducingagentduringglycanlabeling.Thisreagentistoxicsoafumecupboardshouldbeusedduringhandling.ToconformwithemerginghealthandsafetyregulationswearenowreplacingthesewithournewVPglycankitsthatusepicolineboranewhichisasignificantlysaferreductant.
NumberofSamplesOne2-AAlabelingkitcontainsreagentstolabelupto30separateanalyticalsamplesperkit.
Dyepurity>99%byHPLC
Molecularweight137
LamBDa-ex320nm
Lambda-em420nm
AmountofSampleFrom25pmolupto25nmolglycanspersample.
SuitableSamplesAnypurifiedglycanswithfreereducingterminicanbelabeled.
StructuralIntegrityNodetectable(<2molepercent)lossofsialicacid,fucose,sulfate,orphosphate.
LabelingEfficiencyTypically>85%(dependentonsample).
LabelingSelectivityEssentiallystoichiometriclabeling.
Protocol1. PurifytheglycansLudgerCleanEB10cartidges(LC-EB10-A6)havebeendesignedforpurificationofglycansfromproteins,salts,anddetergents.
2.TransfersampletoreactionvialTheamountofsampleshouldbeintherange100picomoles–50nanomolesforaglycanpoolobtainedfromatypicalglycoprotein.Withasinglepureglycanaslittleas5picomolescanbelabeledanddetectedinsubsequentHPLCanalysis.SuitablereactionvialsincludesmallpolypropylenemicrocentrifugetubesandtubesforPCRwork.
3. DrythesamplesIdeally,samplesshouldbedriedusingacentrifugalevaporator.IfthisisnotpossIBLethenfreezedrying(lyophilization)canbeusedwithcaution(inparticular,ensurethatthesampledriestoasmall,compactmassattheverybottomofthevial).Donotsubjectsamplestohightemperatures(>28°C)orextremesofpHastheseconditionswillresultinacidcatalysedlossofsialicacids(hightemperatures,lowpH)orepimerizationoftheglycanreducingterminus(athighpH).
4.PrepareaDMSO-aceticacidmixtureAdd150μLglacialaceticacidtothevialofDMSOandmixbyPipetteaction.
5.AddthedyeAdd100μLoftheDMSO-aceticacidmixturetoavialofthe2-AA(2-aminobenzoicacid)dyeandmixuntilthedyeisdissolved.
6.AddthereductantAddthedissolveddyetoavialofsodiumcyanoborohydrideorpicolineboraneandmixbypipetteactionuntilthereductantiscompletelydissolvedtomakethefinallabelingreagent.
7.Add2-AAlabelingreagenttosamplesAdd5μLoflabelingreagenttoeachdriedglycansample,capthemicrotube,mixthoroughly.
8.IncubatePlacethereactionvialsinaheatingblock,sandtray,ordryovensetat65°Candincubatefor3hours.Inmostcases,theincubationtimecanbeshortenedto2hoursorextendedupto4hourswithoutsignificantlychangingtheoutcomeofthelabelingreaction.
9.CentrifugeandcoolAftertheincubationperiodremovethesamples,centrifugethemicrotubesbriefly,thenallowthemtocoolcompletelytoroomtemperature.
10.SampleCleanupPost-labelingsamplecleanupisrecommendedtoremoveexcessdyeandotherlabelingreagents.CleanupcanbeachievedusingLudgerCleanT1cartridges(LC-T1-A6)orScartridges(LC-S-A6)
2-AALabelingReferences
Anumula,K.R.Quantitativedeterminationofmonosaccharidesinglycoproteinsbyhigh-performanceliquidchromatographywithhighlysensitivefluorescencedetection.AnalyticalBiochemistry220:275-283(1994)
Anumula,KR;Dhume,STHighresolutionandhighsensitivitymethodsforoligosaccharidemappingandcharacterizationbynormalphasehighperformanceliquidchromatographyfollowingderivatizationwithhighlyfluorescentanthranilicacid.GlycoBIOLOGy8:685-694(1998)
Anumula,KR;Du,PCharacterizationofcarbohydratesusinghighlyfluorescent2-aminobenzoicacidtagfollowinggelelectrophoresisofglycoproteins.AnalyticalBiochemistry275:236-242(1999)
Bigge,JC;Patel,TP;Bruce,JA;Goulding,PN;Charles,SM;Parekh,RBNonselectiveandefficientfluorescentlabelingofglycansusing2-aminobenzamideandanthranilicacid.AnalyticalBiochemistry230:229-238(1995)
Frears,ER;Merry,AH;Axford,JSScreeningneutralandacidicIgGN-glycansbyhighdensityelectrophoresis.GlycoconjugateJournal16:283-290(1999)
Huang,Z;Prickett,T;Potts,M;Helm,RFTheuseofthe2-aminobenzoicacidtagforoligosaccharidegelelectrophoresis.CarbohydrateResearch328:77-83(2000)
Sato,K;Sato,K;Okubo,A;Yamazaki,SDeterminationofmonosaccharidesderivatizedwith2-aminobenzoicacidbycapillaryelectrophoresis.strong>AnalyticalBiochemistry251:119-121(1997)
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a)针对双标记探针的引物和探针设计的规则
所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的，因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率，这意味着每次循环中，体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定，那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免，则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中，我们要进行BLAST和类似的分析，以确保特异性。
通用原则
1，先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
2，扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100－150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
3，保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号。
4，为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）
5，将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
b），探针设计指导
1，在设计引物之前设计探针
2，探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区。
3，探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
4，选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
6，探针应尽可能的短，不要超过30个bp。
7，检测探针的DNA折叠和二级结构。
c), 引物设计指导
1，引物的Tm值应在58－60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性最高。
2，引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
3，将引物尽量接近于探针
d循环参数
当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定)，反应要经过95℃，15－20秒，60℃60秒，对于一些模板，45秒也足够了。数据在退火时检测。
e)怎么优化探针和引物的浓度
对于双探针反应，通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果，，能获得最低的CT值，以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。
引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化，下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果
探针浓度应该在50－250nM范围内优化
前引物
后引物50300900
5050/50300/50900/50
30050/300300/300900/300
90050/900300/900900/900
探针的浓度应该从（50，100，250nM）与9种引物浓度相组合，也既是27种可能根据前面所述的循环参数，在Rotor-Gene上进行试验，
选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。
g)进一步的提示
通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM，绝大多数反应都可以在这个浓度下进行，但为了寻找最佳的浓度，还是应该依照上述的步骤。
由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序，因此使用三种退火温度（58，60，62℃）对优化是很有用的。
引物的浓度也会影响溶解温度，高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。
Primer3是个非常有用的软件，但他不能避免3‘端的G，所以我们将3’端的G去除，并观察探针的退火温度是否比引物高8－10度。
f)定量数据的分析
分析定量数据主要有两种基本的方法
i)绝对定量
ii)相对定量
研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据
h)绝对定量
绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品，关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论，理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得，然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因，并与未知样品比较。要注意得是，绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。
在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的，R值，反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整，（或重复相同的标准品），这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说，一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使用者。
ii)相对定量
相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法（⊿⊿Ct）
这种方法可以彻底不需要标准曲线，通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平（normalizer），从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功，目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct（相同的起始模板浓度，两个扩增子的两个CT值的差异）随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同，则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线（斜率<0.01）。这以为着在初始模板浓度范围内，两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致，则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定（1）目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的（2）两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的）
引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。
上游引物：5′-GAATGTGTGTACTGCAAGCA-3′
下游引物：5′-GTTGTATTGCTGTTCTAATGTTGT-3′
Taqman探针：5′-FAM-CAGCATATGGATTCCCATCTC-TAMRA-3′
扩增的产物长度是：195bp(nt188-382)
HPV16全长序列：贴在附件中
磕头跪谢！！！
HPV16.txt(9.91k)
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