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indoor biotechnologies/Natural Ara h 1 (NA-AH1-1)/1/NA-AH1-1
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indoor biotechnologies/Natural Ara h 1 (NA-AH1-1)/1/NA-AH1-1
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Allergen:nAra h 1 (Arachis hypogaea allergen 1), peanut
Unit:250µg
Source: Blanched peanut, crushed (Runner cultivar)
Mol. Wt:64.5 kD (monomer)
Purification:

From delipidated peanut extract by multi-step chromatography. Purity on silver stained SDS-PAGE >95%.

Concentration:

See product insert.

Formulation:

Preservative-free and carrier-free in phosphate buffered saline, pH 7.4. Sterile filtered.

Storage:Store at -20ºC
Notes:(1) Upper band is Ara h 1 trimer. (2) The minor bands below the monomer are Ara h 1 fragments.
PDB:
Product Resources:

Natural Ara h 1 Certificate of Analysis

Focus on... Ara h 1

Allergens are provided for research and commercial use in vitro: not for human in vivo or therapeutic use.
References:
  1. Burks AW, Williams LW, Helm RM, Connaughton C, Cockrell G, O"Brien T. Identification of a major peanut allergen, Ara h 1, in patients with atopic dermatitis and positive peanut challenges. J Allergy Clin Immunol 1991; 88(2):172-9.
  2. Burks AW, Cockrell G, Stanley JS, Helm RM, Bannon GA. Recombinant peanut allergen Ara h 1 expression and IgE binding in patients with peanut hypersensitivity. J Clin Invest 1995; 96(4):1715-21.
  3. Maleki SJ, Kopper RA, Shin D, Park CW, Compadre CM, Sampson H, Burks AW, Bannon GA. Structure of the major peanut allergen Ara h 1 may protect IgE-Binding epitopes from degradation. J Immunol 2000; 164:5844-5849.
  4. Pomés A, Helm RM, Bannon G, Burks AW, Chapman MD. Monitoring peanut allergen in food products by measuring Ara h 1. J Allergy Clin Immunol 2003; 111(3):640-645.
  5. Pomés A, Vinton R, Chapman MD. Peanut allergen (Ara h 1) detection in foods containing chocolate. J Food Prot, 2004;67:793-798.
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近日,国家药品监督管理局经审查,批准了北京纳捷诊断试剂有限公司研制的创新产品“丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)”的注册。该产品基于自主创新的一管法的PCR专利技术,用于体外定量测定血清样本中的丙型肝炎病毒(HCV)核酸(RNA)。该产品适用于需要进行HCV感染检测的患者和接受抗病毒治疗的丙型肝炎患者。国家药品监督管理局鼓励支持医疗器械产业创新发展,进一步做好创新医疗器械审查。食品药品监管部门将加强产品上市后质量监管,保障公众用械安全,确保医疗器械产业的健康有序发展。 查看更多>
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可能这得看你的运气了~我每次反转录三四个都没有问题的~ 因为大部分的引物序列都是一样的~所以没事~不会错配~但是并不排除发生错配的可能~ 我们就有人反转录不出来~U6都出不来~那就分开弄~我没也就是普通的反转录的酶~m-MLV矮Ace矮都。
大学知识即可,不要网上摘的
miRNA引物设计(茎环法+染料法检测)

设计方法:通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物,正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列,反向引物在茎环上。

反转录茎环通用序列:

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC

miRNA序列:

>mmu-miR-99b-5p
MIMAT0000132 Mus musculus miR-99b-5p

CACCCGUAGAACCGACCUUGCG

mmu-miR-99b-5p反转录颈环引物为:

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCAAG

定量PCR反向引物为:TGTCGTGGAGTCGGC

正向引物为:CACCCGTAGAACCGAC
主要看你的产物大小,如果你的PCR产物在80-250bp之间,且用的是SYBR法或有合适的探针,那还是通用的
用blast验证引物和探针的时候,结果什么样可以说明这对引物和探针合格啊?谢谢各位高手帮忙解答!!不胜感激!
各位大侠,本人纯属门外汉,领导安排了任务要设计新的PCR引物或者探针的检验方法,由于本人专业不是很对口,所以希望各位可以给点意见或者具体的方法,感激不尽!!!
我手上有用于RT-PCR的引物和探针(上海合成的,20bp),做培养细胞成功得到结果。现在做体内实验,不知道是否可以用这个探针来作FISH。
有的老师告诉我用甲醛固定的石蜡切片标本,因为石蜡和甲醛本身会激发荧光,作FISH效果不好,而且不容易成功。
这样的话,
1.是否需要重新设计探针做ISH?
2.检测目的mRNA只需要确定位置和在实验条件下发生的量的改变。使用FISH是否大材小用(本来我是希望能节省费用,用以前的引物探针的)?
如果你做的事荧光定量PCR,其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的,只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西,探针法还需要taqman探针,这个探针的设计是比较有讲究的,并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计,一般使用相关软件进行。
一般Taqman定量PCR实验过程为:目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验,优化条件→获得曲线数据,比对标准曲线→再重复验证。
prR的引物一般是RNA(单链),而探针是已知碱基序列的dna或rna
(转载,仅供参考)
a)针对双标记探针的引物和探针设计的规则

所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的,因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率,这意味着每次循环中,体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定,那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免,则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中,我们要进行BLAST和类似的分析,以确保特异性。

通用原则
1,先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
2,扩增子的长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片断约短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
3,保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在SG分析中非特异信号。
4,为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
5,将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。

b),探针设计指导
1,在设计引物之前设计探针
2,探针的Tm值应在68-70℃之间,如果是目测探针,则要仔细审查GC富含区。
3,探针的5’端要避免有鸟氨酸,5’G会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
4,选择C多于G的链作探针,G的含量多于C会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
6,探针应尽可能的短,不要超过30个bp。
7,检测探针的DNA折叠和二级结构。

c), 引物设计指导
1,引物的Tm值应在58-60℃之间,这非常重要,因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃,在这个温度下,5’核酸外切酶的活性最高。
2,引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
3,将引物尽量接近于探针

d循环参数
当引物和探针按照上述原则设计好后,循环的参数也就确定了,当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定),反应要经过95℃,15-20秒,60℃60秒,对于一些模板,45秒也足够了。数据在退火时检测。

e)怎么优化探针和引物的浓度
对于双探针反应,通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果,,能获得最低的CT值,以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。

引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化,下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果
探针浓度应该在50-250nM范围内优化
前引物
后引物50300900
5050/50300/50900/50
30050/300300/300900/300
90050/900300/900900/900
探针的浓度应该从(50,100,250nM)与9种引物浓度相组合,也既是27种可能根据前面所述的循环参数,在Rotor-Gene上进行试验,
选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。
g)进一步的提示
通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM,绝大多数反应都可以在这个浓度下进行,但为了寻找最佳的浓度,还是应该依照上述的步骤。
由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序,因此使用三种退火温度(58,60,62℃)对优化是很有用的。
引物的浓度也会影响溶解温度,高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。
Primer3是个非常有用的软件,但他不能避免3‘端的G,所以我们将3’端的G去除,并观察探针的退火温度是否比引物高8-10度。

f)定量数据的分析
分析定量数据主要有两种基本的方法
i)绝对定量
ii)相对定量
研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据
h)绝对定量
绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析,一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品,关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论,理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得,然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因,并与未知样品比较。要注意得是,绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。

在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的,R值,反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整,(或重复相同的标准品),这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说,一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使用者。
ii)相对定量
相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较,其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法(⊿⊿Ct)
这种方法可以彻底不需要标准曲线,通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平(normalizer),从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功,目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct(相同的起始模板浓度,两个扩增子的两个CT值的差异)随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同,则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线(斜率<0.01)。这以为着在初始模板浓度范围内,两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致,则应该用标准曲线来对基因表达进行定量,或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定(1)目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的(2)两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的)
关键是你稀释后的还是稀释前的,如果没稀释,只要不是在太阳下晒就没事。如果稀释过,建议试用一下。