Biocare’sPromARK™seriesintroducesMouse-on-CanineAP-PolymerDetection.Thisdetectionisspeciallydesignedforusingmouseantibodiesoncanineandfelinetissuesandutilizesbiotin-freealkalinephosphatase(AP)polymertechnology.Theadvantagesofthispolymertechnologyareincreasedsensitivity,reductionofIHCsteps(noAvidin/BiotinblockorLink/Probe),andminimalcross-reactivitytoendogenouscanineandfelineIgG.TheMouse-on-Caninedetectioncanbeusedwithparaffin-embeddedtissuesandcanbeperformedmanuallyoronautomatedstainingplatforms.TheadditionofproprietaryblockerstothedetectionreagentpermitstheuseofanyofBiocareMedical’sretrievalsolutions(Reveal/Borg/Diva)orenzymeswiththeeliminationofendogenousIgGornon-specificbackgroundstaining.TemperaturedependentprotocolscanbeconvenientlyperformedusingBiocare’sDecloakingChamber.TheMouse-on-CanineAP-PolymermaybecombinedwiththeRabbit-on-CanineHRP-PolymertocreateadoublestainpolymerdetectionthatwilllabelthemouseantibodywithAPandtherabbitantibodywithHRP.RefertoTechnicalNotes#5and#6foradditionalinformation.
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在分子生物学中,探针是根据碱基互补的原理,用来与特定的DNA片段做杂交以对特定的DNA片段进行检测,如Southern杂交
引物是用来扩增DNA序列的,因为核苷酸必须要连接在3-OH上才能够合成延伸,引物就是用来提供3-OH的。
只要是符合要求的DNA片段都可以用来做探针和引物,引物是用来扩增DNA序列,探针用来与特定的DNA片段做分子杂交的
PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。
其原理为:
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
原位杂交引物要求:
1. 为了避免检测mRNA时基因组序列的干扰,设计探针时尽量选择在跨内含子的部位。
2. 通常探针的长度(既PCR产物长度)以100-400bp为宜,过长不易穿透组织,杂交效率减低;过短特异性低。
而Realtime引物设计:
1.产物长度80-150bp为宜,可延伸到300bp。
而且你做实时定量的时候,还要做标准曲线,确定引物的扩增效率好不好。

