| 实验步骤 | 水溶性脂高分子/pDNA及脂肽/pDNA复合物的制备及使用材料试剂 重要：所有的溶剂均为HPLC级 支化聚乙嫌亚胺（PEI;1800Da;polysciences) CT-26结肠癌细胞 氯甲酸胆固醇酯 乙醚 二异丙基乙胺溶液（DIPEA;lmol/L，溶于DMF) 二甲基甲酰胺（DMF) 溴化乙锭（0.5ug/ml于1XTBE) 胎牛血清（FBS) 5%葡萄糖注射液 盐酸（HC1;0.lmol/L) 石胆酸 甲醇 二氯甲烷 小鼠（5周龄BAXJB/c;SimonsenLaboratories) 报道基因：CMV启动子驱动的编码萤光素酶的质粒DNA(pCMV_Luc) RPMI1640组织培养基 治疗基因：p2CMVmIL-12,编码鼠il-2亚单元P35与p40,分别受独立的CMC启动子转录控制 三乙胺 三氟乙酸（TFA;95%与5%) Tris-硼酸-EDTA缓冲溶液（TBE;商购或按配方配制，参见SambrookandRus_sell2001) O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸酯（TSTU)溶液(lmol/L溶于DMF) 仪器 琼脂糖凝胶电泳设备 mIL-12p70酶联免疫诊断试剂盒（ELISA)(Pharmingen) 高效液相色谱仪（HPLC)，包括C18柱（Vydac) luminometer(DynexTechnologies) 基体辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF)(^PerspectiveVoyagerDESTR，AppliedBiosystems) 核磁共振波谱仪（NMR)(Varian) 多肽合成议（如AppliedBiosystems433Apeptidesynthesizer)及相关设备 标准组织培养设备及辅助设施 Zeta电位分析仪（ZetaPALS，BrookhavenInstruments) 方法 水溶性脂高分子的合成与表征 1.将3gPEI(1800Da)与IOOmI三乙胺溶解于IOml无水二氯甲烷，于冰浴中搅祥30min。 2.将Ig氯甲酸胆固醇酯溶于5ml冷的二氯甲烷中，缓慢加入上述PEI的溶液中，冰水浴中坪拌12h。产物经干燥后，溶于50ml0.1mol/L的HCl溶液中，过滤。 3.用l00ml二氯甲烷萃取上述水溶液并过滤，滤液浓缩后，沉淀于大量丙酮中，干燥。用甲醇和乙醚洗涤。 4.通过MALDI-T0F，以反式-4-羟基-3-甲氧基肉桂酸为基质，验证产物分子质量。用1HNMR验证其结构。该水溶性脂高分子于一20°C下可以保存6个月。 水溶性脂肽的合成与表征 |
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