Product Information
The BIP-300 plasmid allows you to compare your pAN or pAC AviTagTM fusion gene"s protein expression against a confirmed AviTagTM fusion product under the same growth and induction conditions. When transformed into the same E. coli host strain as your own pAN or pAC AviTagTM fusion plasmid construct, and induced in parallel, the BIP-300 Positive Control Plasmid will provide a measure by which to compare your transformation efficiency, growth and antibiotic maintenance conditions, and induction of your plasmid"s gene-fusion construct. The BIP-300 construct consists of a modified β-galactosidase gene (8 amino acids were deleted from its N-terminus) cloned into Avidity"s pAN5 AviTagTM fusion vector at the Multiple Cloning Site. The resulting AviTagTM-protein fusion (AviTag-β-gal), as are all the pAN and pAC fusion products, is under the tight control of the Trc promoter system and expressed upon IPTG induction. The plasmid is maintained with ampicillin. An example induction protocol is given under Protocols. This protocol uses the Avidity AVB101 E. coli strain containing the BirA over-expressing pACYC-184 plasmid construct (pBirAcm) as the host strain. It is initially requires chloramphenicol for maintenance in addition to the ampicillin required to maintain the pAN or pAC plasmid construct. If you are using a different host strain please adjust the protocol accordingly.
Supplied as 1 vial of Positive Control Plasmid DNA; 2µg at 1mg/mL in nuclease-free water (2µL). Store at -20°C.Avidity是一家开创抗体寡核苷酸结合(AOC)的公司。™)AOCs结合了单克隆抗体的组织选择性和基于寡核苷酸的治疗方法的精确性，以克服寡核苷酸传递的障碍和疾病的目标遗传驱动因素。它们的AOC平台，演示了疾病相关RNA在细胞类型和组织中的调节，包括肌肉、心脏、肝脏、肿瘤和免疫细胞。专有的平台技术可以在单一抗体支架上传递多种治疗性寡核苷酸。AOCs具有类似于抗体的药物性质，并允许将寡核苷酸有效载荷传递到其他运载平台所不提供的非肝组织。AOC也有其独特之处，因为可以处理不可药物的目标。 它们正在推进一系列的治疗计划，重点是罕见的肌肉疾病和其他严重疾病。主要项目是开发治疗杜氏肌营养不良和肌营养不良患者的治疗方法。还与制药合作伙伴合作开展项目。并得到了经验丰富的团队和受人尊敬的生命科学投资者的支持。
带有AviTag标签的人类全长ORF克隆已经被构建在多种T7和CMV启动子表达系统,可以立即购买使用。AviTag标签蛋白可以被体内或体外的生物素连接酶生物素化，而且抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合，正基于这两个反应，AviTag™技术可以应用于蛋白的固定，纯化和显影。虽然Avidity是一个小公司，科学带来的好处及其AviTag已得到认可。目前，AviTag技术已经在22个国家的世界十 大制药公司和研究人员中得到认可。
Avidity带有AviTag标签的人类全长ORF克隆已经被构建在多种T7和CMV启动子表达系统,可以立即购买使用。AviTag标签蛋白可以被体内或体外的生物素连接酶生物素化，而且抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合，正基于这两个反应，AviTag技术可以应用于蛋白的固定，纯化和显影。 Avitag™技术 亲合力开发和销售用于连接分子的分子亲和力工具。我们的zhuan利AviTag™技术采用来自大肠杆菌的生物素连接酶（BirA），在独特的15氨基酸肽标签上使用单一生物素的高度靶向酶促缀合。AviTag™序列是GLNDIFEAQKIEWHE。以链霉抗生物素蛋白包被的表面为导向，这为分子结合相互作用创造了理想的表现形式。 avidity的AviTag技术的科学优势引起了人们的注意。目前，AviTag技术已被全球十大制药公司中的七家授权，并被22个国家的研究人员使用。 Avidity公司历史 avidity LLC由Millard Cull，Larry Lansing，Ron Gill博士和Mark Seville博士于1996年创立，根据生物素对抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的非凡亲和力开发肽标签和分子生物学产品。在Affymax担任研究员期间，Millard参与了AviTag技术的发现，发现了其商业潜力，并获得了Affymax的*权利。他创建了avidity作为试剂公司，将AviTag技术的使用权转让给其他公司，并销售与该技术一起使用的产品。 AviTag历史 AviTag是一种获得zhuan利的生物素标记技术，由Affymax博士在Peter Schatz博士的“定向进化”方法中发现，称为“质粒上的肽”。定向进化方法鉴定了许多可被大肠杆菌的BirA酶生物素化的肽序列，这些序列中蕞 好的被称为AviTag。大肠杆菌酶BirA将15个氨基酸的AviTag生物素化为其天然底物生物素羧基载体蛋白（BCCP）的两倍。 使用AviTag技术的蛋白质的酶促生物素化优于蛋白质的化学生物素化，因为BirA酶温和且高度特异性地标记AviTag的赖氨酸残基。在AviTag之前，最小的生物素接受结构域由75个氨基酸组成。
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1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 （一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二） 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心， 1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。向左转|向右转
最近与战友们探讨原液冻存的问题，各家做的五花八门，做法各不相同。
有的-20度冻存的（有的项目有问题，有的没问题）、有-35度冻存的，有-60度冻存的，有-80度冻存的。
冻存的因素：冻存温度，这个文献等于没说（依据是啥，@fjj8802战友说低于玻璃化转变温度，是否还有别的考虑）、冷冻速率（快，快到什么程度），冻时间（完全冻上，这个貌似需要估计吧，尤其是大量的，如何靠小模型能看出来）、融化温度、融化速率（搅拌）、规模（这个还真不好靠模型来评估）。评估如何来评估冻存的质量好坏，有人说冻融循环，这个小模型适合看蛋白是否对冻融敏感，但是不能很快知道这个蛋白长期冻存的稳定问题。
开本帖探讨原液冻存的注意事项及依据，战友们也可以谈谈自己家目前的做法。
链接：
//d.dxy.cn/detail/12769151
回复：【求助】蛋白制剂处方筛选及稳定性研究参考书，求电子的-蚂蚁淘论坛
CurrentPerspectivesonStABIlityofProteinDrugProductsduringFormulation,FillandFinishOperations.pdf(235.33k)
1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。
2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3. 注意冷冻保护剂之品质，冻存液：10%DMSO+90%FBS,我做细胞试验从不加双抗，NAHCO3-未加
4. 冷冻保存的细胞浓度：
冻存方法
1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
2.收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 离心速度不要大于1000rpm/min或800g/min。
3.离心弃上清，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混匀，分装于无菌冻存管中，1 ml/vial，悬浮细胞可以浓一些。
4.冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。 或4 oC 1h→ -20 oC 1h→ -80 oC 1h(或隔夜) → 液氮槽vapor phase
最常见的我的k562细胞就是这样做的。
阳离子脂质体法 ：稳定转染,瞬时转染,所有细胞使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用。
阳离子聚合物 ：稳定转染,瞬时转染,所有细胞。除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。
1． 37℃水浴预热培养液（HUVEC-004）。
2． 从液氮中取出HUVEC的细胞管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 用75%的酒精擦拭产品管外壁。
3． 将HUVEC的细胞管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃ 基础培养液（HUVEC-004B）培养液4－5ml混匀，边加边摇匀。
4． 用1ml的培养液冲洗HUVEC的细胞管，向15ml离心管中加入冲洗的细胞悬液，边滴加边摇匀。
5． 取10μl细胞悬液和10μl台盼蓝混匀后，取10μl计数。
这一步骤非常重要，能确定您收到的产品是否合格（详见如何计数复苏的细胞）
6． HUVEC的细胞悬液在1500rpm，室温条件下，离心10分钟，去除上清。
7． 加HUVEC完全培养液4－5ml, 轻轻混匀细胞，备用。
8． 接种前将 T25培养瓶中的包被液吸去，按2500－5000个细胞/cm2接种细胞。（1支冷冻的细胞可以种一瓶T25培养瓶）
9. 每个HUVEC的细胞培养瓶中加完全培养液（HUVEC-004）3-5ml, 后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。
我用bioteke的中量全血基因组DNA提取试剂盒（溶液型）提取冻存全血DNA：蛋白质沉淀液处理后上清呈褐色或淡红色，不是无色；在加入异丙醇后是褐色或淡红色絮状沉淀，不是白色絮状DNA沉淀。
我是参照试剂盒说明一步一步来的，请问这是什么原因？
是不是溶血啦，还是蛋白质没有沉淀完全，如何解决这一问题？
感谢啦！
各位大神们，我的课题实验需要提取临床患者抗凝外周血的血浆进行冻存和后续研究，由于血样珍贵，老板让我把离心提取血浆之后所剩的沉淀也加以利用，从剩下的沉淀（血细胞）当中提取出白细胞并冻存，用于之后做western。我用自己的外周血标本试做了一下，5mlEDTA抗凝外周血，3000rpm4℃离心10min后，取上层血浆分装-80冻存用于相关ELAISA实验，然后在下层沉淀（血细胞）中加入3倍体积的溶血剂，静置10min使红细胞裂解之后离心，结果并没有明显的分层，我重复了加溶血剂裂解红细胞并离心的步骤，到最后的结果还是只能达到如图所示。可以看到一层灰白色物质，但无法完全分离提取白细胞，所以想请教各位大神：①我的操作中有哪些错误烦请大家指出；②我用的溶血剂是OptilyseC的溶血剂，是否是试剂的问题？是否需要购买专门的红细胞裂解液，或者自行配制？③为什么裂解红细胞之后分层并不明显，多次离心之后还是分不清楚？④如果可以提取出白细胞，是否可以直接加入冻存液将白细胞-80℃冻存用于之后的研究（主要是Western，不影响细胞内蛋白即可）？因为是第一次做实验，血样珍贵，这种处理方法做过的人也很少，烦请有经验的各位批评指正，向大家虚心请教学习，不胜感激！
做ELISA实验，在处理样本前应该先了解收集样本的注意事项。
【标本收集注意事项】
1.收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2.血清和血浆避免使用溶血，高血脂标本。
3.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4.标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃，-80℃电冰箱内，避免反复冻融。
5.可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数) 。
6.收集标本，尽量做到双份的用量，避免一次实验失败，重复实验时标本缺失，从而耽误实验进程。
7.收集标本时，应该做好防护措施（比如戴手套，口罩，护目镜等），认为所有标本都具有一定的潜在危险性。
8.样本处理应该在生物安全柜里面，并且正确使用生物安全柜。
样本正确的处理方法应该是这样的：
【标本处理办法】
1.血清：将采集的全血静置冰箱4℃过夜，然后1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
2.血浆：用EDTA，枸橼酸钠，肝素等作为抗凝剂，加入血液混匀后，1000-3000rpm离
心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）
保存。
3.组织匀浆：切取组织块，0.01MPBS中过洗一次；按照1G组织加入5-10ml组织蛋白萃取试剂的比例，在冰水中匀浆。匀浆完成后，5000-10000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
4.细胞培养上清：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
5.尿液，腹水，脑脊液等：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃3-6个月）保存。
注：样品稀释的一般原则
用户须查阅相关文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。样品的稀释应有详细记录。
希望可以给您提供帮助，祝您科研顺利！
2×miRcute。
