流式细胞仪细胞术(FCM)简述
| 实验方法原理 | 常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1.077±0.001的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，水性高，平均分子量为400000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 淋巴细胞分离液血清肝素 试剂、试剂盒 | 肝素Hank's液PBS 仪器、耗材 | 滴管吸管针头碘酒酒精棉球止血带计数板显微镜离心机 实验步骤 | 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank"s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank"s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。 4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank"s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 4个大方格内细胞总数 单个核细胞浓度（细胞数/1毫升细胞悬液）＝────────×104×2（稀释倍数） 4 6. 细胞活力检测 死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。 活细胞数 活细胞百分率＝────── ×100％ 总细胞数 用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在90％以上。 注意事项 | 1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。 3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。 4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。 其他 | 一、附录 1. Hank"s液（无Ca2＋、Mg2＋）配制法 NaCl8.0克，KCl0.4克，Na2HPO4·12H2O0.12克，KH2HPO40.06克，葡萄糖1.0克，双蒸水1000毫克，1％酚红液2毫克 将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。 2. 细胞分层液配制法 9％聚蔗糖24份，34％泛影葡胺10％ 混合，测比重为1.077～1.078，G5玻璃滤器过滤除菌。4℃冰箱保存备用。 A液 0.2MNaH2PO4溶液，NaH2PO427.6克，或NaH2PO4·2H2O31.2克，蒸馏水，溶解至1000毫升 B液 0.2MHa2HPO4溶液，Ha2HPO4·12H2O71.6克，蒸馏水溶解至1000毫升 各种不同PH值PB的配法 ─────────────────────────────────────── PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 ─────────────────────────────────────── A液（ml） 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5 B液（ml） 61.0 72.0 81.0 87.091.094.5 ─────────────────────────────────────── 举例 0.1M PH7.2PB A液28毫升，B液72毫升，加蒸馏水100ml 4. 血球保存液 葡萄糖2.05克，枸椽酸钠0.8克，氯化钠0.42克，蒸馏水100毫升 将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶（100毫升）。经10磅、10分钟高压灭菌。4℃保存备用。 5. 培养液配置 RPMT-1640（FLOW公司出品）1袋，三蒸水1000毫升，电磁搅拌30分钟：1NHCl调PH7.2～7.4（约加2.5毫升），过滤除菌，作无菌试验，4℃保存。 （2）不完全RPMI-1640培养液 RPMI-164095毫升，0.1M丙酮酸钠1毫升，0.2M谷氨酰胺1毫升，1M Hepes1毫升，7.5％NaHCO31毫升，青霉素、链霉素（各1万单位）1毫升 （3）完全RPMI-1640培养液 不完全1640培养液90毫升，灭活胎牛（或新生牛）血清10毫升 |
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发布于 ： 2021-07-26
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