
Features:
-Nonpathogenicwithleastimmuneresponse.
-Excellentgenedeliveryefficiencyinmostcelltypesincludingdividingandnon-dividingorprimarycells.
-Persistenttransgeneexpression.
-MultipleSEROtypes(AAV-1,AAV-2,AAV-3,AAV-4,AAV-5,AAV-6,AAV-8,AAV-9,AAV-DJ/8andAAV-DJ).
Large AAVcisvectorinventory forconstructingAAVcisplasmidwith aspecificpromoterandreporter:
SinglepromoterrAAVcisvector | DualpromoterrAAVcisvector | |||
Promoterless |
| Promoterless | CMV | eGFP |
ServiceDescription:
-Cloningyourgeneofinterest(GOI)intoAAVcisvector.
-rAAVcisplasmidlargeprep.
-rAAVpackagingin1xcellstack.
-rAAVpurificationviaadvanced2xCsClultra-centrifugation.
-Desalting,filtersterilizationandAAVtitrationviaqPCR.
rAAVSerotypesWeOffer:
AAV-1,AAV-2,AAV-3,AAV-4,AAV-5,AAV-6,AAV-7,AAV-8,AAV-9,AAV-PHP.B,AAV-DJ/8andAAV-DJ.
RequiredMaterials:ANCBIaccession#orgenesymbolorplasmidDNAcarryingyourgeneofinterest(GOI).
TurnaroundTime:2~3weeks.
Deliverables:>0.2mL(4x50µL)ofsuperpurifiedinvivograderAAVvectorat>1E+13VG/mL*.
Weofferdiscountfornewcustomer,pleaserequestaquotewithustoday.
SuperHighYield:
WithourproprietarygeneticallyengineeredAAV·HT™packagingcellandaadvancedpurificationapproach,therAAVyieldiseasytoreachsuperhighlevel--------total1E+15VG.ForsuperhighlevelrAAVproductionupto1E+15VGtotal,pleasecontactustorequestaquote.
Figure1.AcomparisonofpurityandinfectivityofrAAVvectorsfromdifferentsourcesshowingsuperpurifiedandsuperinfectious(closetoclinicaltrialgrade)rAAVvectorpreparedviaouradvanceddoubleCsClultra-centrifugationapproach.
A.rAAVvectors(total1E+9VGperlane) fromdifferentsourceswereresolvedonSDS-PAGEfollowedbysilverstaining. Lane1:GMPmanufacturedrAAVvectorfromCHOP;Lane2:rAAVpreparedviaouradvanced2xCsClultra-centrifugationapproach;Lane3:rAAVfromVectorCoreofBCM;Lane4:rAAVfromourcompetitor"V";Lane5:rAAVfromourcompetitor"C";Lane6:ProteinMarker.
B.SuperinfectiousrAAVvectorpreparedviaadvanceddoubleCsClultra-centrifugation. Leftpanel:rAAV9-GFP(total5E+9VG)fromourcompetitor"V"injectedtomouseeye;Rightpanel:rAAV-9-GFP(total5E+9VG)purifiedviaadvanced2xCsClultra-centrifugationinjectedtomouseeye.
Figure2.AcomparisonofinfectivityofrAAVvectorsfromdifferentsourcesshowingsuperpurifiedrAAVpreparedviaadvanceddoubleCsClultra-centrifugationapproachissuperinfectious.
rAAV1-GFP(total2E+9VG)fromdifferentsourceswereinjectedtomousemuscletissue. TheGFPfluorescencewasvisualized3weekspostinjection. A.rAAV1-GFPfromourcompetitor"V";B.rAAV1-GFPfromourpre-maderAAVsstockpurifiedviaadvanceddoubleCsClultra-centrifugation. C.QuantificationdatashowedthatoursuperpurifiedrAAV(bar2)is~9timesmoreinfectiousthanthat(bar1)preparedviaconventionalCsClultra-centrifugation.
*Finalviralyieldmaydependonthenatureoftransgene.
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其次要看下你选择单位的规模如何,做的比较好的,还是上海这边的,你可以看下基尔顿生物,原代细胞培养,动物造模,整体课题外包。
不建议你用MDCK细胞,非常难转染。
GFP发出绿色荧光的原理是Ca离子进入GFP的beta-barrel结构中引起的特定能级,因此只要这个结构仍然保持着,就可以发出荧光。
由于GFP的beta-barrel结构非常稳定,一些版本的GFP蛋白(如EGFP)甚至能抵抗94C的高温几分钟而不完全变性,因此想在溶液状态下去掉GFP的荧光是很难的,一般需要用光漂白法。
基于其非常稳定的结构,即便细胞被固定了,仍然会有一部分的GFP蛋白保持其构象而发出荧光。此时荧光可能较弱。在荧光显微镜下是有可能看得到的。
我刚开始做转染,悬浮细胞,分别做过表达和敲减,看了很多文献,大都没有提及转染后是用转染的这同一批细胞同时做pcr,wb,cck8,凋亡,细胞周期;还是说这次转染只做pcr或wb,再转染一次做cck8或细胞周期。剩下的功能试验均同前,转染一次做一次?我养的是悬浮细胞,转染后做cck8这些功能试验前需要离心换液吗?跪谢解答!
可以用移液器将细胞吸出来并高速离心,沉淀重悬于PBS中洗涤,接着就可以裂解提取蛋白了。可以用超声,酶解等等,裂解后离心收集上清。
其次要看下你选择单位的规模如何,上海这边的,你可以看下基尔顿生物,原代细胞培养,动物造模,整体课题外包。
实验室一直都是用日常型质粒抽提试剂盒,转染细胞没问题。
我觉得只要是注意以下2点就可以了:
1,注意大肠杆菌(Escherichia coli)本身的污染,收集菌体沉淀时防止菌液散落,经常用75%的乙醇擦拭手套。
2,最后洗脱时最好使用无内毒素的水,我们是用注射用水的。
无论是小提还是大提我们都是用的日常型的,并没有刻意用转染级的,因为转染量大,去内毒素的操作太麻烦,损失太大。
转染分2种,一种是瞬时转染,即转染后让细胞表达目的蛋白后即提取蛋白,提一次蛋白,转染一次,这种方式一般不传代;
另一种转染为稳定转染,转染后加入一定选择压力进行筛选,没有转染的细胞不能存活,只留下转染的细胞,这种情况下可以筛选单个转染细胞,构建稳定表达某一特定蛋白或基因的细胞系。

