Name | 2x Es Taq Master Mix (with dye) | ||||||||||||||||||
Cat. # | W0690-1 $ 39.00 (1 mL, 100 rxn, 20 ul/rxn) $ 99.00 (5 mL, 500 rxn, 20 ul/rxn) How to pay with  | ||||||||||||||||||
Application |
This product is for research use only. | ||||||||||||||||||
Specifications |
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Description and features | This Master Mix contains Es Taq DNA Polymerase, PCR buffer, Mg2+, dNTP, PCR stabilizer and PCR enhancer.The concentration is 2x. Es Taq DNA Polymerase possesses 5´→3´ DNA polymerase and 5´→3´ exonuclease activity. The polymerase has the high amplification efficiency and low mismatching as Taq DNA polymerase and high fidelity of Pfu DNA polymerase. Es Taq Polymerase catalyzes the non-template directed addition of an adenine residue to the 3´-end of both strands of DNA molecules to make it suitable for T/A cloning.The amplification range of Es Taq is ~ 6 kb. This unique Master Mix recipe makes the system very reliable.More than 98% of PCR reaction can get successful amplification during the first try.It also works well on complicate templates. The Master Mix contains dye, and can directly run electrophoresis after PCR reaction. | ||||||||||||||||||
Shipping / Storage | Ship at 4℃. Store at -20℃ for up to 1 year and avoid freeze-thaw cycles. Stored at 4℃ for up to 3 months. | ||||||||||||||||||
Quality control | This product is tested for no exogenous nuclease activity;no host DNA contamination tested (by PCR);able to amplify single copy gene from multiple genomes; and no significant enzyme activity decrease after storing at 2 ~ 8oC for 3 months. | ||||||||||||||||||
Manual (protocol) |  | ||||||||||||||||||
Components |
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PCR reaction system |  Note: The recommended primer concentration for PCR is between 0.1-1.0 µM of each primer. The use of higher concentrations of primers can have higher amplification effect. Low primer concentration will generally ensure cleaner product and lower background. | ||||||||||||||||||
PCR reaction conditions |  Note:
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PCR result examination | This Master Mix contains dye for electrophoresis.After PCR, directly load 5 µL of PCR product to agarose gel to run electrophoresis.No need to add loading buffer. | ||||||||||||||||||
 | Exosome Isolation | Purity > 95% |
| Protein Extraction | 1 min total protein, 40 min membrane protein |
| 3D Cell Culture Gel | 30% < mkt=""> |
| PCR Kits | 50% < mkt=""> |
| Beta-Hexosaminidase Activity Colorimetric Assay | Fast and sensitive, High-throughput |
| Endotoxin-Free Plasmid Kits | maxi, midi and mini-prep |
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用,靠.规模析文库克隆.
1)同源探针:至少含所需cDNA克隆部确切序列.用于部克隆离cDNA文库全克隆.
2)部同源探针:探针序列与所要筛选cDNA克隆序列相关相同.用于克隆家族基.
3)总cDNA探针:
通反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通总或级离poly(A)+mRNA进行末端标记获cDNA探针.
cDNA扣除探针:
第种mRNA制备cDNA探 针, 连续与20倍量第二种mRNA杂交;
收未杂交cDNA探针, 再与100倍量第种mRNA杂交, 使原mRNA些特异序列高度富集.
* 主要用于探测cDNA文库与调节水平所差别mRNA克隆.
5)合寡核苷酸探针
2 特异性免疫检测
cDNA表达文库,目基表达产 物能与特异性抗体发免疫反应,通酶加检测
3 cDNA克隆同胞检测
cDNA文库若干组含10-100克隆易于处理亚cDNA文库,每组亚cDNA文库进行检测,鉴定阳性库再断其更细库进行检测,直获阳性单克隆.
4 cDNA克隆确证
cDNA克隆含编码某特定蛋白质完整氨基酸序列放读框.
第四节 目基离
外源基:
插入载体内特定片段基.
目基:
些已或者准备要离,改造,扩增或表达特定基或DNA片段.图" class="ikqb_img_alink">
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：
1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！
4. 所有成分加完后，离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
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MicroRNA（miRNA,微RNA）：即为长度为22nt左右的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。
小的干涉RNA（siRNA）：是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。
miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。4.二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。5.miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。
miRNA与siRNA的不同点：1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
miRNA分离纯化测序
miRNA和RNA干扰相关资料
miRNA和RNA干扰-蚂蚁淘论坛
miRNA功能分析
miRNAPPT（我下载了一下很不错）
miRNA的加工
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小分子量的RNA怎么证明就是miRNA?
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RNA干扰技术
MicroRNA重要文献
小RNA，siRNA，miRNA研究进展
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siRNA转染浓度问题-蚂蚁淘论坛
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回复：【求助】siRNA转染的两个问题，请教过来人-蚂蚁淘论坛
siRNA转染阴性对照
magiclyj战友整理的关于siRNA资料
分子生物学常规技术帖子整理(长期有效）——有奖征集-蚂蚁淘论坛
供参阅，大家可以多多参与交流！
来源：生物谷2016-02-2610:26
2016年2月26日讯/生物谷BIOON/--药物的发现是一项非常艰巨的工作，其需要化学家们从数百万种化合物中筛选最终寻找最适合的那一个，而DNA技术或许就可以明显加速药物的发现之旅。
在麻省沃尔瑟姆市一个普通混凝土楼房二楼的实验室冰箱中保存着一个具有明确标识的检测管，该管中含有天文学数字尺度那么多的混合物，而这些众多的化合物属于制药公司葛兰素史克(GSK)所有，其中包含有1万亿个特殊的DNA标记的分子，其数量是银河系中行星数量的10倍。
这些文库可以帮助制药公司和生物技术公司快速鉴别出可以和疾病蛋白配对的候选药物，尤其是那些很难靶向作用的参与疾病的特殊蛋白质；药物的发现通常都从科学家们开始组装大量的化合物文库开始，随后研究者就会检测这些化合物靶向作用蛋白的效力，这些化合物通常会被加入到每一个包含靶点的孔中来观察是否化合物是否会影响这些靶点的活力，这种方法称之为高通量筛选（high-throughputscreening，HTS），其通常是利用机器人设备自动化地对数百万种化合物进行检测，但目前这种技术的花费非常昂贵，而且有时候并不总是会成功。
过去一些年里，药物化学家已经通过利用条形码样的DNA来对化合物进行标记从而帮助发现更加有用且有效的化合物，这些DNA编码的文库通常会提供多种药物寻找的优势；这样一来研究者们就会将所有DNA标记的分子置于单一的混合制剂中，随后引入靶向蛋白，这样一来结合靶向蛋白的任何一种化合物就会被轻松鉴别出来，而这都得感谢DNA条码的帮助。1992年科学家们首先提出DNA编码文库，DNA编码文库并不会取代高通量筛查技术，很多制药公司目前已经重金投资到了HTS中，而且利用DNA编码技术有时候并不能合成一些化合物，但相比较而言DNA编码技术却会为科学家们提供一种快速、高效且廉价地寻找结合靶点的化合物的技术，比如泛蛋白连接酶，其会对蛋白进行标记并进行处理，同样也可以在癌症疗法中被靶向标记。
大即是美（Bigisbeautiful）
当前GSK公司拥有世界上最大的DNA编码文库（DNA-encodedlibrary），该文库是一般公司200万化合物高通量筛查文库的50万倍。构建DNA编码文库有很多种方法，最大的一种，就像GSK公司的，其是通过利用DNA记录的方法来进行的。化学结构单元，比如氨基酸、胺类和羧酸类，其都可以被合成同时通过化学反应被标记以“DNA条形码”，第二种结构元件就会加入到反应混合物中从而制造一种新分子，同时DNA条形码就会被加长；通过加入四种元件，化学家们就可以开发出药物样的分子，由于存在数千种的结构元件，因此潜在的组合将会是非常巨大的。
相比常规的HTS文库而言，DNA编码文库非常容易维护且使用，一种DNA编码文库可以被储存于单一的检测管中，而HTS文库则需要机器人设施，而相应的设施需要足够大才可以储存每一种化合物。
未来DNA编码文库不仅将会更大更加广泛，而且还会提供很多机会帮助快速应用于临床中去，随着常规筛查的进行，药物化学家们有时候不得不花费数年时间来调节化合物使其变得特殊且安全地用于临床中。相比之下，大尺寸的DNA编码文库意味着科学家们可以寻找到更加适合临床使用的化合物，尽管有些化合物仍然需要优化，但至少科学家们距离成功已经很近了。
其它生物技术公司也相继表示对DNA编码文库非常感兴趣，这些公司不仅利用DNA标签来鉴别特殊化合物，而且以其作为模板来制造新的DNA标签，DavidLiu是来自哈佛大学的一位化学家，他的学生开发出了一种“DNA-模板”方法，同时利用该方法构建了特殊环状分子的文库（macrocycle，包含15个原子以上的大环），这些大型稳定的环状分子可以在多个位点同靶点相互作用，从而增强结合反应的特异性。（GSK和X-Chem公司的DNA编码文库中拥有大量的macrocycle分子）。
首先Liu开发了一种单链DNA模板作为向导，随后将DNA标记的结构元件加入到反应器中，依赖于DNA碱基配对，在物理性上将标记的结构元件从一个结合到另一个，最终的反应就会将线性的结构元件转化成为环状的macrocycle分子，而每一个该分子都会被限制成为特殊的DNA条形码。目前Liu的团队构建的包含14000个大分子的文库已经带来了部分成功，2014年，他们就报道发现了一种特殊稳定的小分子可以有效阻断胰岛素降解酶类（IDE），该酶和2型糖尿病直接相关，为此研究者们还准备研究IDF在健康和疾病中所扮演的角色。
甜蜜的筛选（SweetScreens）
一旦文库建成，下面的乐趣就是鉴别可以吸附靶点的分子了；很多研究依赖于“亲和筛选”来寻找目的化合物，正因为如此他们工程化操作蛋白质使其靶向作用一系列纯化的标签，随后利用纯化标签离开结合对，并且通过包含文库的混合体，最后一步就是利用DNA测序仪来阅读和小分子相关的DNA标识符，这种方法最终就会产生大量的靶向蛋白。但基于亲和的方法往往尤其不足之处，“笨拙”的DNA标记有时候反而会阻碍其同靶点的反应，同时就会使得很多潜在的候选化合物流失，但因为DNA编码文库非常巨大，因此这些损失通常情况下可以被忽略不计；然而有问题的是小分子和其标签通常会结合到纯化柱上，这样就会产生假阳性的结果，纯化的标签也会被靶向蛋白的结构所干扰，从而引入不可靠的数据。
当然很多公司都相继解决了上述问题，Vipergen公司就是其中一个，该公司拥有5000万个分子的DNA模板文库，它们也希望开展这项浓缩的策略；公司的行政总裁NilsHansen表示，试想一下，我们可以冻结蛋白混合物文库并且将其切割成为非常小的小方冰块，如果这些冰块足够小，每一个都包含有单一的靶向蛋白，那么在这个尺寸下进行靶点结合的小分子就会在包含靶点的小方冰块中进行持续过度反应。
当前利用游离漂浮的可溶性蛋白进行DNA编码文库的筛选非常好，但很多潜在的药物靶点都嵌合到了细胞表面，这就使得利用传统的亲和筛查技术变得不太可能，比如大约有40%的被批准的药物都可以靶向作用膜结合的G蛋白偶联受体，因为这些受体分子通常在细胞外部感知分子的存在，为此筛选膜结合蛋白的技术就必须更新换代。其中一种方法就是将DNA编码的文库同完整的可以过度表达膜结合靶点的细胞混合，随后小型分子就会在细胞表面同靶点进行结合；当研究者冲洗掉未结合的文库后，他们就可以通过加热细胞并且阅读被洗脱的DNA标签来鉴别出结合小型分子；在这一方面GSK公司已经利用该方法鉴别出了一系列潜在的受体抑制剂，这些受体参与到了精神分裂症及中枢神经系统障碍的发病中。
当然X-Chem公司也开始看到了进行膜结合蛋白筛查的商机，Wagner表示，从历史观点上来讲，我们的程序主要还是利用可溶性的蛋白，但考虑到最近数据的转变我们已经开发出了相对困难的膜结合蛋白。
未来DNA编码文库的规模还会扩大，而且新型的筛选方法也会打开未知的生物空间，DNA编码文库也将会成为帮助制药公司探索发现新药的支柱之一。（生物谷Bioon.com）
RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。
RNAi的定义
目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。
如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。
各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。
原理
最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。
这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。
有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1 RNA（11）转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。
另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。
RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验（17）。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。
上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。
总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。
应用
siRNA可用于研究基因的功能，可是后基因组时代的今天，研究人员已经不满足于一个一个基因沉默这样的研究节奏了，功能基因组学的研究更需要一个能站在全局高度研究多个基因之间关系的工具，因此，用作大规模RNA干扰用的shRNA/siRNA文库应运而生。 shRNA/siRNA文库联合使用高通量筛选技术和高内涵图像分析技术，使得RNAi筛选在反向基因组学、功能基因研究、药物发现等多个领域成为了一个 强大的应用工具。
北京赛诺亚生物技术有限责任公司（http://www.sirnoa.com/）是一家拥有独立自主产权的、以RNAi筛选的相关产品和技术服务为重点生物高新技术企业。公司专业从事各种高通量miRNA检测、RNA干扰筛选、药物筛选、文库筛选及相关产品的研发和销售，同时提供进行各种RNAi相关的载体构建、病毒包装 服务和细胞生物学试剂。公司致力于为从事生命科学研究和早期药物研发的科研人员提供一站式的RNA干扰相关服务。
总结
经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。
