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入戏2iQ9g26
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基因捕获载体在基因组中也有“hot”和“cold”插入位点。但是计算机模拟显示,按照单个克隆被捕获的百分比,如果以多种类型的载体进行足够多次的突变实验所获得的突变克隆就可以覆盖整个ES细胞基因组中全部基因位点 。因此,新型捕获策略和载体不断被设计应用。早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源基因的读码框一致时,产生由内源蛋白的N 末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质 。近来对这一类载体所做的改进是在报告基因与SA 序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES ,这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES 细胞中大量基因具转录活性,为了获得全基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。因此,在第一、二代基因捕获载体中应用报告基因和含自身启动子( PGK) 的筛选标记基因neo ,抗药性的产生不需要捕获基因的表达。不同的是,第二代基因捕获载体中筛选标记基因3′末端没有polyA 加尾信号而含有一剪接供体序列 ,必须由内源基因提供polyA 加尾信号以产生稳定的筛选标记基因mRNA 而获得筛选克隆,因此与第一代载体相比,降低了基因间插入的背景。polyA 捕获载体还解决了第一代基因捕获载体突变基因信息鉴定的难题。3′- RACE 可用以鉴定polyA 捕获基因3′端编码序列或3′非翻译区(UTRs) 序列信息,对于基因鉴定比5′- UTRs 序列有用得多。用以克隆捕获特异类型蛋白编码基因的多种新型载体也已问世,如Skarnes 等利用分泌蛋白的原理及β-gal 活性在内质网被灭活的特点设计了一种载体专门用以捕获在ES 细胞中表达的编码穿膜分泌蛋白的基因 。一些研究小组还在载体中引入了重组位点,以实现由重组酶介导的捕获位点插入后修饰 。这种“敲进 ”的策略允许对捕获位点作进一步修饰,如“指派”捕获基因的启动子成分驱动敲入的转基因表达来进行“回复突变( rescue) ”或细胞标记实验;通过敲入含不同突变的捕获基因cDNA 还可产生等位基因系列;含lox 位点的载体还可实现在捕获基因组条件性取代载体产生更精细的突变,包括点突变和/ 或选择性表型标记,可以更好地控制突变的性质。向左转|向右转
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