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NEB/NEBNext® Singleplex Oligos for Illumina®/E7350S/12 reactions
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Description:
TheNEBNextSingleplexOligosforIlluminacontainsadaptorsandprimersthatareideallysuitedforsamplepreparationfornext-generationsequencingontheIlluminaplatform(Illumina,Inc.).Eachofthesecomponentsmustpassrigorousqualitycontrolstandardsandislotcontrolled,bothindividuallyandasasetofreagents.
EachsetofreagentsisfunctionallyvalidatedtogetherthroughconstructionandsequencingofaDNAlibraryontheIlluminasequencingplatform.
LotControl
Thelotsprovidedaremanagedseparatelyandqualifiedbyadditionalfunctionalvalidation.Individualreagentsundergostandardenzymeactivityandqualitycontrolassays,andalsomeetstringentcriteriaintheadditionalqualitycontrolslistedoneachindividualcomponentpage
ReagentsSupplied
Thefollowingreagentsaresuppliedwiththisproduct:
| Storeat(°C) | Concentration | |
| USER®Enzyme | -20 | |
| NEBNextUniversalPCRPrimerforIllumina | ||
| NEBNextIndex1PrimerforIllumina | ||
| NEBNextAdaptorforIllumina |
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2018-12-26
Growth hormone plays a major role in regulating growth during childhood and adolescence and also regulates metabolism. Defects in growth hormone signaling can 查看更多
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2018-12-26
Presentation at the World Veterinary Poultry Association, Cairo, Egypt, January 2002 p.200Introduction: Mycoplasma infection continues to be an important cause 查看更多
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2018-12-26
General comments: Antibodies, like most proteins, do not like to be freeze-thawed. Avoid repetitive freezing of your solution. The best way to store your antib 查看更多
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The Fc Epsilon Receptor 1 signaling pathway in mast cells uses multiple core signal path to achieve its necessary ends. Through the BTK protein and PKC Mast ce 查看更多
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2018-12-26
Purpose: To break up high molecular weight human placental DNA into fragment sizes of 500 bp or less which can be used as competitor DNA in Southern and in sit 查看更多
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2018-12-26
MEMFA Fix10xMEMFA Salts1 part 10x MEMFA salts1 M MOPS1 part 37% formaldehyde20mM EGTA8 parts water10mM MgSO410x salts can be autoclaved and stored. Turns yello 查看更多
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2018-12-26
细胞培养的支原体污染和分型 点击浏览该文件一种消除细胞培养中污染支原体的简单方法 点击浏览该文件应用聚合酶链反应对细胞培养液中支原体的方法 点击浏览该文件用基因突变细胞检测支原体 点击浏览该文件 查看更多
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Arshad DesaiNotes:The key variable in MT spindown experiments is ATP. Under high ATP conditions,conventional MAPs are selectively co-sedimented with microtubul 查看更多
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2018-12-26
血清热灭活―您是否在浪费时间？血清的热灭活是很多培养者感兴趣的话题，价格不菲的血清中含有诸如生长因子，维生素，氨基酸等珍贵物质，而将它们置于50℃以上的温度长达30分钟是完全没有必要的。尽管如此，在大多数实验室之中血清的热灭活还是作为常规来执行，多数实验者并没有考虑热处理对 查看更多
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2018-12-26
人工设计转录因子来调控目标基因的表达已经不是梦想，基于锌指蛋白结构域的设计已经展开。锌指蛋白结构域能够结合于特定的三个碱基配对的DNA序列上。RNA干扰和反义核酸技术能够抑制基 查看更多
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2018-12-26
OverviewMatirgel is considered as basement membrane and generated from EHS sarcoma. Matrigel contains not only basement membrane components (collagens, laminin 查看更多
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2018-12-26
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫 查看更多
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基因工程技术又称为DNA重组技术.回答相关问题:(1)在基因工程中....123
腐烂的哆啦A梦2021-08-24
cDNA文库需要由总RNA反转录而来，cDNA文库的构建需要反转录法。反转录紧紧是一种方法，cDNA文库是一种资源。
cDNA文库的构建方法与原理 123
Onobel2021-08-23
不知道大家做过人的retina的CDNA文库构建吗？
我从未做过，不知道以下四种：
StandardcDNALibraries
LargeinsertcDNALibraries
NormalizedcDNALibraries
SubtractedcDNALibraries
其中StandardcDNALibraries和NormalizedcDNALibraries，SubtractedcDNALibraries有啥区别阿？
我只是想构建文库，以后可以用来做southern的probe，或者以后可以拿来做做蛋白方面的等等。
还有两个问题：
1.大家cDNA文库构建的时候都是先直接提取mRNA的吧？大家推荐以下用什么kit？
2.先提取总RNA然后再提取mRNA；直接从组织中提取mRNA.这两者有什么主要区别？
不好意思，如果提的问题是有错误，多多包涵。。。
我从未做过，不知道以下四种：
StandardcDNALibraries
LargeinsertcDNALibraries
NormalizedcDNALibraries
SubtractedcDNALibraries
其中StandardcDNALibraries和NormalizedcDNALibraries，SubtractedcDNALibraries有啥区别阿？
我只是想构建文库，以后可以用来做southern的probe，或者以后可以拿来做做蛋白方面的等等。
还有两个问题：
1.大家cDNA文库构建的时候都是先直接提取mRNA的吧？大家推荐以下用什么kit？
2.先提取总RNA然后再提取mRNA；直接从组织中提取mRNA.这两者有什么主要区别？
不好意思，如果提的问题是有错误，多多包涵。。。
建立cdna文库时cdna的合成条件123
双鱼座o862021-08-08
cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法
基因组文库和cDNA文库的构建及筛选123
Cy_诅咒你哦2017-12-07
基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。
...知道要写基因组文库还是cdna文库还是部分基因文库～怎 123
lushao7202017-12-07
这种题要根据题干内容来定。
（1）人的免疫球蛋白细胞 cDNA文库（cDNA 文库是把内含子去除后的裸DNA，人的和牛的DNA是不能识别的就是因为内含子的缘故，cRNA反转录后的是去除后的）。
（1）人的免疫球蛋白细胞 cDNA文库（cDNA 文库是把内含子去除后的裸DNA，人的和牛的DNA是不能识别的就是因为内含子的缘故，cRNA反转录后的是去除后的）。
关于酵母单杂交自激活的问题 分子生物 EMSA/ChIP 论坛...123
隔霂龉苜焢垭痉2021-08-09
酵母单杂交pabai可以不用线性化载体
酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。
酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。
酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
检测CDNA文库克隆中插入片段大小的简易方法123
维尼01782017-10-01
mRNA模板经反转录酶催化体外反转录cDNA步骤应该与DNA复制程类似需要原料mRNA模板四脱氧核糖核苷酸逆转录酶能量注意：获DNA片段含非编码区序列专业答).构建cDNA文库：物细胞总mRNA模板用反转录酶合互补双链cDNA接载体转入宿主建立基文库cDNA文库1、mRNA提取及其完整性确定1）总RNA提取RNA提取：APGC或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA离高等真核物mRNA3'端均poly(A)尾总RNA通寡聚（DT）纤维柱离mRNA或利用磁珠制备纯mRNA某些情况裂解细胞用蔗糖梯度制备mRNA-核糖体复合物作提取mRNA替换途径3）mRNA纯化①按照总mRNA进行级主要用琼脂糖凝胶电泳蔗糖密度梯度离进行级；②聚核糖体免疫纯化利用抗体纯化合目肽4）mRNA完整性确定确定mRNA完整性三种：①直接检测mRNA；②测定mRNA转译能力；③检测总mRNA指导合cDNA第链能力2、cDNA合克隆1）cDNA第链合用亲层析mRNA根据mRNA3'端poly(A)尾结构原理用12~20核苷酸oligo（dT）与纯化mRNA混合oligo（dT）与poly(A)结合作反转录酶引物反转录反应产物条RNA-DNA杂交链oligo（dT）结合mRNA3'端合全cDNA需要反转录酶mRNA端移另端种全合难达尤其mRNA链建立种随机引物合cDNA随机引物种度6~10核苷酸由4种碱基随机组DNA片段与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合同mRNA同位点结合随机引物合产物RNA-DNA杂交体cDNA克隆载体前必须种杂交体RNA转变DNA链即形双链DNA2）.双链cDNA合合cDNA第二条链两种种利用cDNA第链3'末端现发夹环特征种发夹结构反转录酶第链末端返折并且进行复制第链结合cDNA第二链提供用引物用种合双链cDNA端发夹环用单链特异S1核酸酶切S1核酸酶处理修剪cDNA顺序使cDNA丢失mRNA5'端部顺序另种用肠杆菌RNaseH进行修饰RNaseH能识别RNA-DNA杂交并其RNA切割短片段些RNA短片段仍与cDNA第链结合新合DNA所取代新合DNA存切口用DNA连接酶些切口连接起形条完整DNA链RNaseH优于S1核酸酶能获包括mRNA5'端全部或绝部更顺序cDNA3）cDNA重组载体合cDNA与载体DNA进行连接般3种：①借助于末端转移酶3'-OH端合均聚物能力双链cDNA线性化载体DNA3'-OH端别加均聚核苷酸链；②双链cDNA线性化载体DNA别用Klenow片段进行末端补平用T4DNA连接酶进行齐连接形重组体；③通粘性末端连接4）.转化重组载体DNA定条件转化入肠杆菌形携带质粒菌株同重组DNA含同cDNA基整转化含自mRNA群体各种cDNA基转化群体构该mRNA全部遗传信息cDNA基文库5）.目cDNA克隆鉴定用于cDNA文库筛选鉴定目cDNA主要3种：①核酸杂交②免疫杂交检测③cDNA同胞选择
【求助】cDNA文库构建需要注意那些方面 核酸基因技术123
yshu35072021-08-13
Clontech公司的SMART cDNA文库构建试剂盒都有哪些东西... 123
liansuzhao2021-07-31
CRISPR文库构建时涂板菌总是长得太少怎么办? 核酸基因技术讨论...123
lavender_ting2017-03-10
下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中.不正确的是( )A.cDNA...123
hispringapril2017-12-07
目的基因来自真核生物，受体细胞为原核细胞，需要用CDNA文库。
基因组文库是一个比较笼统的概念。这个文库可以指某种真核生物的基因组，也可以指某种原核生物的基因组。实质是将某种生物的全部遗传信息贮存在一个受体菌群体中，做为目的基因的来源。
基因组文库是一个比较笼统的概念。这个文库可以指某种真核生物的基因组，也可以指某种原核生物的基因组。实质是将某种生物的全部遗传信息贮存在一个受体菌群体中，做为目的基因的来源。
为什么RNA干扰后,目的基因mRNA的干扰效率比蛋白干扰效率要高123
灰太狼馗志1662021-08-01
正常 因为mRNA的翻译效率不同啊 而且对mRNA的检测更加灵敏 当然也就是更加不准确 WB也是各种不准 反正肯定效率不同啦
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