商品信息
联系客服
郑重提醒：
无质量问题不接受退换货，下单前请仔细核对信息。
下单后请及时联系客服核对商品价格，订单生效后再付款。
NEB/NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina® (Index Primers 1-48)/E7560S/96 reactions
免费咨询热线
4000-520-616
Description:
TheNEBNextMultiplexSmallRNALibraryPrepKitforIllumina(IndexPrimers1-48)containstheadaptors,primers,enzymesandbuffersrequiredtoconvertsmallRNAsintoindexedlibrariesfornext-generationsequencingontheIlluminaplatform.Thenovelworkflowhasbeenoptimizedtominimizeadaptor-dimers,whileproducinghigh-yield,high-diversitylibraries.Eachkitcomponentmustpassrigorousqualitycontrolstandards,andeachsetofreagentsisfunctionallyvalidatedtogetherbyconstructionandsequencingofaindexedsmallRNAlibrariesontheIlluminasequencingplatform.
Forlargervolumerequirements,customizedandbulkpackagingisavailablebypurchasingthroughtheOEM/BulksdepartmentatNEB.PleasecontactOEM@neb.comforfurtherinformation.
NEBNextMultiplexSmallRNALibraryPrepKitforIllumina(IndexPrimers1-48)
ReagentsSupplied
Thefollowingreagentsaresuppliedwiththisproduct:
| Storeat(°C) | Concentration | |
| NEBNext3´LigationReactionBuffer | -20 | 2X |
| NEBNext3´LigationEnzymeMix | -20 | |
| NEBNext3´SRAdaptorforIllumina | -20 | |
| NEBNext5´SRAdaptorforIllumina | -20 | |
| NEBNext5´LigationReactionBuffer | -20 | |
| NEBNext5´LigationEnzymeMix | -20 | |
| NEBNextSRRTPrimerforIllumina | -20 | |
| NEBNextFirstStrandSynthesisReactionBuffer | -20 | 5X |
| ProtoScript®IIReverseTranscriptase | -20 | 200,000units/ml |
| MurineRNaseInhibitor | ||
| LongAmp™Taq2XMasterMix | -20 | 2X |
| NEBNextIndex1-48PrimersforIllumina | -20 | |
| NEBNextSRPrimerforIllumina | -20 | |
| GelLoADIngDye,Blue | 25 | 6X |
| Quick-LoadpBR322DNA-MspIDigest | -20 | 50μg/ml |
| DNAGelElutionBuffer | -20 | 1X |
| LinearAcrylamide | -20 | 10mg/ml |
| TEBuffer | -20 | |
| Nuclease-freeWater | -20 |
蚂蚁淘电商平台
ebiomall.com
ebiomall.com
公司简介
蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
该平台由多位经验丰富的生物人和IT人负责运营。蚂蚁淘B2B模式是指客户有采购意向后在蚂蚁
淘搜索全球供应信息，找到合适的产品后在蚂蚁淘下单，然后蚂蚁淘的海外买手进行跨境采购、
运输到中国口岸，最后由蚂蚁淘国内团队报关运输给客户...
蚂蚁淘承诺
正品保证： 全球直采 在线追溯
蚂蚁淘所有产品都是自运营的，我们已经跟国外多家厂方建立品牌推广合作关系, 获得对方的支持和授权； 同时客户可以通过订单详情查看到货物从厂方至客户的所有流程， 确保货物的来源； 正规报关，提供13%增值税发票。
及时交付： 限时必达 畅选无忧
蚂蚁淘的运营团队都是有着多年经验的成员，他们熟悉海外采购、仓储物流、报关等环节； 同时通过在线的流程监控，蚂蚁淘的进口速度比传统企业提高了50%以上， 部分产品甚至能做到7-10天到货，即蚂蚁淘的“时必达”服务。
轻松采购： 在线下单 简单省事
蚂蚁淘的价格是真实透明的，并且具有很大的价格优势，不需要繁杂的询价比价； 报价单与合同可以直接在线生成或打印；就像在京东购物一样， 您的鼠标点击几 次即完成在蚂蚁淘的采购，订单详情会告诉您所有进程。
售后申请： 耐心讲解 优质服务
蚂蚁淘提供的产品在使用过程中如因产品质量问题有售后需求时， 您可通过我的订单提交您的“申请售后”， 蚂蚁淘产品顾问会第一时间为您处理， 在售后服务过程中如遇到问题也可致电蚂蚁淘客服热线：4000-520-616。
2021-07-14
DNA文库严格来讲应称作cDNA文库，中文名称是基因文库，是指某生物基因组中所有可表达的基因片段，经mRNA反转录后获得相应的cDNA的集合，将这些cDNA的集合经转入和克隆后贮存于受体细胞群落中，这个受体细胞群落即构成该生物的cDNA文库。... 查看更多
>
2018-12-26
1。细菌保存于穿刺培养物中：一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记 查看更多
>
2018-12-26
For amplification of cognate sequences from different organisms, or for "evolutionary PCR", one may increase the chances of getting product by designing 查看更多
>
2021-08-12
色谱法分类 色谱法有多种类型，也有多种分类方法。 （一）按两相所处的状态分类 液体作为流动相，称为“液相色谱”（liquid chromatograp-hy）；用气体作为流动相，称为“气相色谱”（gas chromatogr-aphy）。固定相也有两种状态，以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定 查看更多
>
2018-12-26
Cell Isolation Techniques Methods and MaterialsWorking With EnzymesAll of the enzymes Worthington offers for tissue dissociation applications are available as 查看更多
>
2018-12-26
Presentation at the World Veterinary Poultry Association, Cairo, Egypt, January 2002 p.200Introduction: Mycoplasma infection continues to be an important cause 查看更多
>
2021-08-29
An important part of characterizing any protein molecule is to determine its size and shape. Sedimentation and gel filtration are hydrodynamic techniques that 查看更多
>
2018-12-26
I. Safety Procedures A. ChemicalsA number of chemicals used in this laboratory are hazardous. All manufacturers of hazardous materials are required by law to s 查看更多
>
2018-12-26
When we first started using X. tropicalis, in vitro fertilization had an extremely poor efficiency. However, with the careful selection of a mature male and th 查看更多
>
2021-07-29
(this protocol was adapted by Joe DeRisi from one developed at Rosetta Inpharmatics) Resuspend the contents of one pack of the monofunctional NHS-ester Cy3 or 查看更多
>
2018-12-26
Materials 0.1M NaHC03 pH9 DMSO NHS-Biotin (N-Hydroxysuccinimidobiotin, Sigma #H-1759) PBS Procedure Dialyze the sample against carbonate buffer. After dialysis 查看更多
>
2018-12-26
Four hours after boosting with hCG, the females are ready to begin laying eggs. The best test is to see if there are eggs in the holding buckets. Also, the clo 查看更多
>
常见问题
蚂蚁淘所售产品均为正品吗？
蚂蚁淘的创始人兼CEO是钟定松先生，具有十年的从业经验，在业界享有良好的口碑；
Ebiomall是跨境直采平台，我们直接从厂家采购，自己的团队负责国际物流和清关，中间没有第三方，蚂蚁淘承诺所售产品仅为正品，假一罚十。
下单后可以修改订单吗？
未确认状态的订单可以修改，打开“订单详情”页面，点击右上角的“修改订单”即可，若已审核确定，则订单无法修改。
商品几天可以发货？
现货产品付款审核后即可发货,大部分期货产品在3周左右即可到货,提供时必达服务的产品订单审核十天内即可发货。
订单如何取消？
如订单处于未确定状态，进入“我的订单"页面，找到要取消的订单，点击“取消订单”按钮。
可以开发票吗？
本网站所售商品都是正规清关，均开具13%正规发票，发票金额含配送费金额，另有说明的除外。
如何联系商家？
蚂蚁淘任何页面都有在线咨询功能，点击“联系客服”、“咨询”或“在线咨询”按钮，均可咨询蚂蚁淘在线客服人员，
或拨打4000-520-616，除此之外客户可在 联系我们页面找到更多的联系方式。
收到的商品少了/发错了怎么办？
同个订单购买多个商品可能会分为一个以上包裹发出，可能不会同时送达，建议查看订单详情是否是部分发货状态；如未收到，可联系在线客服或者致电4000-520-616。
退换货/维修需要多长时间？
一般情况下，退货处理周期为客户收到产品一个月内（以快递公司显示签收时间为准），包装规格、数量、品种不符，外观毁损、短缺或缺陷，请在收到货24小时内申请退换货；特殊商品以合同条款为准。
商品咨询
下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中.不正确的是( )A.cDNA...123
hispringapril2017-12-07
目的基因来自真核生物，受体细胞为原核细胞，需要用CDNA文库。
基因组文库是一个比较笼统的概念。这个文库可以指某种真核生物的基因组，也可以指某种原核生物的基因组。实质是将某种生物的全部遗传信息贮存在一个受体菌群体中，做为目的基因的来源。
基因组文库是一个比较笼统的概念。这个文库可以指某种真核生物的基因组，也可以指某种原核生物的基因组。实质是将某种生物的全部遗传信息贮存在一个受体菌群体中，做为目的基因的来源。
rna干扰123
fupeining2021-08-29
你在哪看到加的
基因组文库和cDNA文库的区别_123
2017-12-07
对于真核生物来说，cDNA文库里面获取的基因缺了内含子和非编码区等。
cDNA是DNA转录成RNA再逆转录获得的，而在转录时，原DNA上的内含子和非编码区都会被加工切掉，只剩下原DNA编码区上的外显子对应的RNA片段，再逆转录的话，得到的cDNA就跟原DNA不同了。
所以要基因组测序，提供cDNA文库是不够的
cDNA是DNA转录成RNA再逆转录获得的，而在转录时，原DNA上的内含子和非编码区都会被加工切掉，只剩下原DNA编码区上的外显子对应的RNA片段，再逆转录的话，得到的cDNA就跟原DNA不同了。
所以要基因组测序，提供cDNA文库是不够的
为什么cDNA文库可以进行物种间的基因交流,而基因组文库只有部分...123
912绵绵艹猪B2021-08-20
cDNA文库是通过RNA反转录得来的，真核生物含有内含子(即转录为RNA后会被剪掉不表达的部分)，而原核生物不含内含子，所以cDNA文库适用于真核生物，基因组文库适用于原核生物
全长cDNA文库的构建——SMART技术 实验方法123
feeling2021-07-25
多功能酶标仪的用途有哪些123
天阶小雨2021-07-21
基因组dna文库和cdna文库的区别 123
流泪的魔术师2017-12-07
一、 DNA文库和cDNA文库的概念
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
二、 DNA文库和cDNA文库的构建原理
DNA文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
三、DNA文库和cDNA文库的用途
基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA展开
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
二、 DNA文库和cDNA文库的构建原理
DNA文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
三、DNA文库和cDNA文库的用途
基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA展开
【求助】急啊,cDNA文库如果要是测序的话,是用原始文库测序还是用...123
xiejiazhen2021-08-12
建立cdna文库时cdna的合成条件123
双鱼座o862021-08-08
cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法
建立cDNA文库最重要的酶是（ ）。_123
我是涂涂00572017-12-02
反转录酶：以mRNA为模板反转录合成DNA。
限制性内切酶：酶切目的基因和载体，使其产生相同的粘性末端。
DNA连接酶：连接目的基因和载体。
限制性内切酶：酶切目的基因和载体，使其产生相同的粘性末端。
DNA连接酶：连接目的基因和载体。
SiRNA高通量筛选123
夏夏xr142017-11-05
Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸）,由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成.SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默.
RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解,从而导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象.
RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性.siRNA在RNA沉默通路中起中心作用,是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素.siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的因子.siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成.由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候,Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶,具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域,III型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合,形成酶-dsRNA复合体.Dicer 切割后形成siRNA,然后,在ATP的参与下,细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白.siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA.其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制.siRNA识别靶序列是有高度特异性的,因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应.
RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性,所以是基因功能研究的重要工具.
大多数药物属于标靶基因（或疾病基因）的抑制剂,因此RNAi 模拟了药物的作用,这功能丢失（LOF)的研究方法比传统的功能获得（GOF)方法更具优势.因此, RNAi 在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具.同时,那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物.
在药物标靶发现和确认方面,RNAi技术已获得了广泛的应用.生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞,然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因.如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因.一旦所发现的基因属于可用药的靶标（如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外）,就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选.此外,被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认.
在疾病治疗方面,双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗,如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等.在抗病毒治疗方面,帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法.肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果.
RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解,从而导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象.
RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性.siRNA在RNA沉默通路中起中心作用,是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素.siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的因子.siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成.由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候,Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶,具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域,III型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合,形成酶-dsRNA复合体.Dicer 切割后形成siRNA,然后,在ATP的参与下,细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白.siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA.其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制.siRNA识别靶序列是有高度特异性的,因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应.
RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性,所以是基因功能研究的重要工具.
大多数药物属于标靶基因（或疾病基因）的抑制剂,因此RNAi 模拟了药物的作用,这功能丢失（LOF)的研究方法比传统的功能获得（GOF)方法更具优势.因此, RNAi 在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具.同时,那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物.
在药物标靶发现和确认方面,RNAi技术已获得了广泛的应用.生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞,然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因.如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因.一旦所发现的基因属于可用药的靶标（如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外）,就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选.此外,被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认.
在疾病治疗方面,双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗,如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等.在抗病毒治疗方面,帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法.肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果.
基因工程技术又称为DNA重组技术.回答相关问题:(1)在基因工程中....123
腐烂的哆啦A梦2021-08-24
cDNA文库需要由总RNA反转录而来，cDNA文库的构建需要反转录法。反转录紧紧是一种方法，cDNA文库是一种资源。
▍
品牌分类
▍
官网分类
▍
品牌问答
