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NEB/NEBNext® End Repair Module/E6050S/20 reactions
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4000-520-616
Description:
TheNEBNext®EndRepairModulehasbeenoptimizedtorepairDNAfragmented bynebulization,acousticshearing,ornucleases.FragmentedDNAisconvertedbytheNEBNextEndRepairModuletobluntendedDNAhaving5´-phosphatesand3´-hydroxyl.TheNEBNextEndRepairModuleisprovidedasamastermixtomaximizeefficiencyandconvenienceinDNAsamplepreparationworkflows.
DNArepairedbytheNEBNextEndRepairModulecanbesubsequentlyconvertedtoDNAhaving3´dA-tailswiththeNEBNextdA-tailingModuleoruseddirectlyforbluntendcloningorbluntendedadaptorligation.
TheNEBNextEndRepairModulehasbeenvalidatedbysequencingwithanIlluminasequencerinconjunctionwiththeNEBNextdA-TailingModule,NEBNextQuickLigationModuleandPhusion™High-FidelityPCRMasterMix,andNEBNEXTHighFidelity2XPCRMasterMix.
TheNEBNextEndRepairModulehasalsobeenvalidatedbysequencingwith454GSFLXTitaniuminconjunctionwiththeNEBNextQuickLigationModuleandtheNEBNextAdapterFill-inandssDNAIsolationModule.
Forlargervolumerequirements,customizedandbulkpackagingisavailableby purchasingthroughtheOEM/BulksdepartmentatNEB.Pleasecontactnebsolutions@neb.comforfurtherinformation.
ReagentsSupplied
Thefollowingreagentsaresuppliedwiththisproduct:
| Storeat(°C) | Concentration | |
| NEBNextEndRepairEnzymeMix | ||
| NEBNextEndRepairReactionBuffer | -20 | 10X |
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蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
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2018-12-26
Injection of C. elegansline up three 22x50 mm coverslips place drop of molten 2% agarose on each quickly place slide on top of the agarose and wait 20 seconds 查看更多
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众所周知，科研工作者在进行医药方面的科学研究之前，需要制定完善的统计研究设计方案，那么什么样的设计方案才称得上是完善的呢？一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：实验所需的人力、物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计 查看更多
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2018-12-26
The scanning translation initiation model suggests that 40S ribosomal subunit preloaded with factors bind to the 5’ end of the mRNA near the cap. The 48S subu 查看更多
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2018-12-26
When we first started using X. tropicalis, in vitro fertilization had an extremely poor efficiency. However, with the careful selection of a mature male and th 查看更多
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2018-12-26
互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法 查看更多
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2021-09-03
Microtubule Spindowns for Visual Analysis Microtubule spindowns for visual analysis can be performed on single microtubules or microtubules nucleated from axon 查看更多
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2021-07-27
Preparation of Fluorescent DNA Probe from mRNA: YeastLast updated: 3/29/99 Materials for 2 reactions (Cy3 & Cy5) Qty Order info Heat blocks, 42C & 70C 查看更多
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Arshad DesaiNotes:The key variable in MT spindown experiments is ATP. Under high ATP conditions,conventional MAPs are selectively co-sedimented with microtubul 查看更多
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2021-07-30
Preparation of salt buffersThe buffers are used for both HPLC purification and Sep-Pak purification.High salt buffer (HSB):1M triethylammonium acetate, pH 8.0 查看更多
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2018-12-26
第一种方法：使用泰乐菌素（tylosin），Sigma，120多块钱泰乐菌素是一种兽用抗生素,常用在鸡、猪的食料辅料，可以防止支原体感染引起的支气管哮喘，至今尚未见有耐药菌株，是治疗支原体感染的特效药。第二种方法：M-Plasmocin：InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地 查看更多
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Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, & Allard RW (1984) PNAS 81:8014-8018DNA successfully isolated from fungal species of Cochliobolus, Aternaria, a 查看更多
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2018-12-26
人工设计转录因子来调控目标基因的表达已经不是梦想，基于锌指蛋白结构域的设计已经展开。锌指蛋白结构域能够结合于特定的三个碱基配对的DNA序列上。RNA干扰和反义核酸技术能够抑制基 查看更多
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miRNA 在植物病毒基因组中的靶基因预测及分析123
dxy_6zlecemq2021-08-28
已经在mirbase数据库下载水稻的所有miRNA序列，可以比对某种昆虫的转录组文库寻找靶基因吗？
可以用targetscan或者miRwalk网站吗？有什么方法吗？
建立cdna文库时cdna的合成条件123
双鱼座o862021-08-08
cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法
几种全长cDNA文库构建方法比较123
shuishang992017-12-02
区别就是全长cDNA文库中全长cDNA的比例更高，好的一般能达到50%及以上。
【求助】紧急求助各位做过cDNA文库方面实验的大侠,本人是新手123
monking2021-08-25
【编译】《 N Engl J Med》RNA干扰的潜在治疗作用_问答详情_文库_...123
martin47202004-12-31
正如科学家们想象的那样，通过基因调控的主要机制，可以使得基因沉默，也就是CaenorhaBDitiselegans提出的可行的RNA干扰技术，通过促进RNA降解来实现基因沉默。科学家们在不同生物系统中业已发现了控制干扰RNA的途径，以对基因进行调控。同时，科学家们也在努力实现通过利用干扰RAN技术来阻断疾病（比如HIV-1，肝炎病毒，流感病毒的感染）的发展。
TherapeuticPotentialofRNAInterference
MarioStevenson,Ph.D.
nengljmed351;17www.nejm.orgoctober21,2004
Justwhenscientiststhoughttheyhadfiguredoutthefundamentalmechanismsthroughwhichgeneexpressionisregulated,studiesofthenematodeCaenorhabditiselegansrevealedtheexistenceofapathway,nowknownasRNAinterference(RNAi),thatsilencesgeneexpressionbypromotingdegra-dationofRNA.ScientistshavediscoveredwaystocontrolRNAiinordertoregulategeneexpressioninavarietyofBIOLOGicsystems,andtheyareresearchingwaystohar-nessRNAitointerruptdiseaseprocessessuchasthosecausedbyhumanimmunodefi-ciencyvirustype1(HIV-1),hepatitisviruses,andinfluenzavirus.
中英双语微生物学术语对照.pdf(676.0k)
TherapeuticPotentialofRNAInterference
MarioStevenson,Ph.D.
nengljmed351;17www.nejm.orgoctober21,2004
Justwhenscientiststhoughttheyhadfiguredoutthefundamentalmechanismsthroughwhichgeneexpressionisregulated,studiesofthenematodeCaenorhabditiselegansrevealedtheexistenceofapathway,nowknownasRNAinterference(RNAi),thatsilencesgeneexpressionbypromotingdegra-dationofRNA.ScientistshavediscoveredwaystocontrolRNAiinordertoregulategeneexpressioninavarietyofBIOLOGicsystems,andtheyareresearchingwaystohar-nessRNAitointerruptdiseaseprocessessuchasthosecausedbyhumanimmunodefi-ciencyvirustype1(HIV-1),hepatitisviruses,andinfluenzavirus.
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检测CDNA文库克隆中插入片段大小的简易方法123
维尼01782017-10-01
mRNA模板经反转录酶催化体外反转录cDNA步骤应该与DNA复制程类似需要原料mRNA模板四脱氧核糖核苷酸逆转录酶能量注意：获DNA片段含非编码区序列专业答).构建cDNA文库：物细胞总mRNA模板用反转录酶合互补双链cDNA接载体转入宿主建立基文库cDNA文库1、mRNA提取及其完整性确定1）总RNA提取RNA提取：APGC或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA离高等真核物mRNA3'端均poly(A)尾总RNA通寡聚（DT）纤维柱离mRNA或利用磁珠制备纯mRNA某些情况裂解细胞用蔗糖梯度制备mRNA-核糖体复合物作提取mRNA替换途径3）mRNA纯化①按照总mRNA进行级主要用琼脂糖凝胶电泳蔗糖密度梯度离进行级；②聚核糖体免疫纯化利用抗体纯化合目肽4）mRNA完整性确定确定mRNA完整性三种：①直接检测mRNA；②测定mRNA转译能力；③检测总mRNA指导合cDNA第链能力2、cDNA合克隆1）cDNA第链合用亲层析mRNA根据mRNA3'端poly(A)尾结构原理用12~20核苷酸oligo（dT）与纯化mRNA混合oligo（dT）与poly(A)结合作反转录酶引物反转录反应产物条RNA-DNA杂交链oligo（dT）结合mRNA3'端合全cDNA需要反转录酶mRNA端移另端种全合难达尤其mRNA链建立种随机引物合cDNA随机引物种度6~10核苷酸由4种碱基随机组DNA片段与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合同mRNA同位点结合随机引物合产物RNA-DNA杂交体cDNA克隆载体前必须种杂交体RNA转变DNA链即形双链DNA2）.双链cDNA合合cDNA第二条链两种种利用cDNA第链3'末端现发夹环特征种发夹结构反转录酶第链末端返折并且进行复制第链结合cDNA第二链提供用引物用种合双链cDNA端发夹环用单链特异S1核酸酶切S1核酸酶处理修剪cDNA顺序使cDNA丢失mRNA5'端部顺序另种用肠杆菌RNaseH进行修饰RNaseH能识别RNA-DNA杂交并其RNA切割短片段些RNA短片段仍与cDNA第链结合新合DNA所取代新合DNA存切口用DNA连接酶些切口连接起形条完整DNA链RNaseH优于S1核酸酶能获包括mRNA5'端全部或绝部更顺序cDNA3）cDNA重组载体合cDNA与载体DNA进行连接般3种：①借助于末端转移酶3'-OH端合均聚物能力双链cDNA线性化载体DNA3'-OH端别加均聚核苷酸链；②双链cDNA线性化载体DNA别用Klenow片段进行末端补平用T4DNA连接酶进行齐连接形重组体；③通粘性末端连接4）.转化重组载体DNA定条件转化入肠杆菌形携带质粒菌株同重组DNA含同cDNA基整转化含自mRNA群体各种cDNA基转化群体构该mRNA全部遗传信息cDNA基文库5）.目cDNA克隆鉴定用于cDNA文库筛选鉴定目cDNA主要3种：①核酸杂交②免疫杂交检测③cDNA同胞选择
CRISPR文库构建时涂板菌总是长得太少怎么办? 核酸基因技术讨论...123
lavender_ting2017-03-10
【求助】请教个基因组文库构建的问题 核酸基因技术讨论版...123
zyism_2021-07-23
基因组酶切后，切胶回收浓度大概为多少才可以进行下一步实验？为什么二十几的浓度和载体连不上呢？载体也明明去磷酸化了，单连载体的时候也不会自连。那为什么把载体和酶切后的基因组连起来转化后挑菌做PCR验证却有很多空载呢？我的基因组酶切大小为2kb~4kb。上面那排7kb~10kb的带是什么东西呢？
cDNA文库的构建方法与原理 123
Onobel2021-08-23
不知道大家做过人的retina的CDNA文库构建吗？
我从未做过，不知道以下四种：
StandardcDNALibraries
LargeinsertcDNALibraries
NormalizedcDNALibraries
SubtractedcDNALibraries
其中StandardcDNALibraries和NormalizedcDNALibraries，SubtractedcDNALibraries有啥区别阿？
我只是想构建文库，以后可以用来做southern的probe，或者以后可以拿来做做蛋白方面的等等。
还有两个问题：
1.大家cDNA文库构建的时候都是先直接提取mRNA的吧？大家推荐以下用什么kit？
2.先提取总RNA然后再提取mRNA；直接从组织中提取mRNA.这两者有什么主要区别？
不好意思，如果提的问题是有错误，多多包涵。。。
我从未做过，不知道以下四种：
StandardcDNALibraries
LargeinsertcDNALibraries
NormalizedcDNALibraries
SubtractedcDNALibraries
其中StandardcDNALibraries和NormalizedcDNALibraries，SubtractedcDNALibraries有啥区别阿？
我只是想构建文库，以后可以用来做southern的probe，或者以后可以拿来做做蛋白方面的等等。
还有两个问题：
1.大家cDNA文库构建的时候都是先直接提取mRNA的吧？大家推荐以下用什么kit？
2.先提取总RNA然后再提取mRNA；直接从组织中提取mRNA.这两者有什么主要区别？
不好意思，如果提的问题是有错误，多多包涵。。。
基因组dna文库和cdna文库的区别 123
流泪的魔术师2017-12-07
一、 DNA文库和cDNA文库的概念
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
二、 DNA文库和cDNA文库的构建原理
DNA文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
三、DNA文库和cDNA文库的用途
基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA展开
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
二、 DNA文库和cDNA文库的构建原理
DNA文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
三、DNA文库和cDNA文库的用途
基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA展开
全长cDNA文库的构建——SMART技术 实验方法123
feeling2021-07-25
多功能酶标仪的用途有哪些123
天阶小雨2021-07-21
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