近期刚接触有关黄色短杆菌(G+)的代谢途径修饰,根据相关文献及实验室已有资料,选择pk18mobsacB这一穿梭型的自杀载体进行敲除。
目标基因全长1800bp,通过重叠延伸的方式获得的自杀敲除组件,左右同源序列均为500bp左右,构建自杀载体(确认载体没有问题),期望进行目标基因的失活处理,但将近1个月的时间,不见任何目的克隆,故在此请各位战友指点。
采用电转的方式将自杀载体(约6700bp)导入黄色短杆菌,感受态的细胞制备采用相关文献方式,甘氨酸和吐温-30的方式进行摇菌并制备电转感受态,1800v电转(电压进行过梯度,1200、1500、1800、2200、2500。1800v效果相对较好,故选之),但电转效率仍是较低,复苏2h,浓缩涂板LBG+kan(kan浓度20ug/ml),平板克隆很少,几次都只有20个左右的克隆。
1)克隆很少,原因可能跟菌株的电转效率有关,不知战友有没有谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌相关较好的电转经验,还请指教?
2)抗性平板克隆很少,还可能和重组效率有关,但根据pk18mobsacB质粒的特性,既然能在抗性平板生长,理论上应该是已经进行了一次重组了,但结果是不管我用pk18载体本身的Kan序列引物还是最终诱导进行PCR验证,均未证实到一次重组的发生,更不要说获得敲除失活的目的菌株了。问题是这个带有抗性的克隆到底是携带了什么使其同样具有抗性(显微检验不是杂菌)?如何有效提高或促进自杀载体在宿主内的重组效率呢?或是更有效的准确的检测验证手段??
3)利用自杀载体的方式进行黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)的基因敲除缺失比较不易,不知有没有正在做这方面相关研究的战友,希望能够多多交流和学习。。。
不知道我的疑惑讲清楚了没有,若哪里不清楚还请指出,我再细说。。。期望xdjm们的帮助啊。。。先谢过了。。
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