【讨论】慢病毒载体 感染 目的细胞[精华]
2009-07-03
问题描述：
用三质粒系统构建慢病毒颗粒，如附件；
问题
1AmpR是在筛选阳性质粒时发挥作用；
2氨卞青霉素只对原核生物起作用；
3在病毒颗粒感染目的细胞后，AmpR并未在目的细胞中表达（或者说没整合入目的细胞基因组）
4如果有整合入目的细胞基因组，那么可以起到药物筛选的作用吗？
慢病毒系统构建.doc(182.0k)
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aaron928
用户
楼主看来是需要先好好补习一下分子生物学的基础，分清楚针对不同细胞的不同耐药基因（比如像Amp，Kana对原核；Neo, Puro对真核等等，推荐好好看看分子克隆，呵呵）。根据你的实验目的，如果要筛选整合到基因组的细胞，你可以利用Neo，Puro的药物筛选，也可以利用GFP，YFP，m-Cherry的荧光筛选！关于慢病毒包装过程，现在iPSC研究如火如荼，随便一篇好的paper都会提到Lenti/Retroviral转染系统，个人推荐好好看看最先发在Nat. Biotech那篇详细介绍lentiviral的文章。大概的过程gongtj战友已经介绍过了，补充几点：1.转染细胞推荐用293T/FT，方法用脂质体或磷酸钙皆可；2. 细胞接种密度过大或过稀皆不好；3. Transfection过程最好在8-16小时之间，千万不能太长，否则滴度直线下降；4. 换液时需特别小心，尽可能轻柔且迅速，经过transfection后的细胞非常脆弱，稍不留神很容易detach,这是我血的经验和教训；5. 收集上清时间因人而异，我一般是收转染后48和64小时2次，结果不错，当然有的人可以从24一直收到72,这需要你自己摸索；6.是否需要超速离心浓缩病毒取决于你的目的，浓缩可以提高滴度，但步骤麻烦且需特别小心，不提倡初学者使用，我一般不经浓缩的病毒上清最后也能接近10的7次方左右，做绝大部分的实验已经绰绰有余了，一味盲目地追求滴度最终来可能两手空空；7.关于滴度的检测，比较精确的就是用不同稀释比例的病毒上清去感染（infection）293T/FT细胞（这个质粒需要带荧光标记），24-48小时上流式检测，再根据公式计算。说了这么多，都是自己做病毒1年多的一些心得体会，以求抛砖引玉，版上肯定还有很多高人，只是没有露面而已，祝你好运，呵呵！
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zx_0504
用户楼上说的很明白了。我再罗嗦几句。公司做好的质粒你回来要在原核中（E.coli）扩增备份的，否则几次就用完了啊！AmpR是为了让你在原核里面扩增质粒时候用的筛选抗性。扩增好留有备份后就可以转染目的细胞了。这时候需要有Neo,Puro或荧光表达进行筛选。这是两类不同目的的和用途的筛选。
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gongtj
用户我想lz是搞错了一个问题：在慢病毒包装的过程中，不需要通过AmpR来筛选阳性颗粒。AmpR的作用仅是AllowsselectionoftheplasmidinE.coli。AmpR不会被重组到Lentiviralvector中，后面如果要检测是否整合到细胞基因组，可以通过GFP。以(pMDL,pRevandpVSVG)系统为例，病毒包装的过程大概如下：Day1:SeedcellsDay2:TransfectcellsDay3:ChangemediaDays4and5:CollectsupernatantDay6:ConcentratetheviralpreparationDay7:PurifytheviralpreparationthroughasucrosecushionDays8–11:TitertheviralsUSPension
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aaron928
用户楼主看来是需要先好好补习一下分子生物学的基础，分清楚针对不同细胞的不同耐药基因（比如像Amp，Kana对原核；Neo,Puro对真核等等，推荐好好看看分子克隆，呵呵）。根据你的实验目的，如果要筛选整合到基因组的细胞，你可以利用Neo，Puro的药物筛选，也可以利用GFP，YFP，m-Cherry的荧光筛选！关于慢病毒包装过程，现在iPSC研究如火如荼，随便一篇好的paper都会提到Lenti/Retroviral转染系统，个人推荐好好看看最先发在Nat.Biotech那篇详细介绍lentiviral的文章。大概的过程gongtj战友已经介绍过了，补充几点：1.转染细胞推荐用293T/FT，方法用脂质体或磷酸钙皆可；2.细胞接种密度过大或过稀皆不好；3.Transfection过程最好在8-16小时之间，千万不能太长，否则滴度直线下降；4.换液时需特别小心，尽可能轻柔且迅速，经过transfection后的细胞非常脆弱，稍不留神很容易detach,这是我血的经验和教训；5.收集上清时间因人而异，我一般是收转染后48和64小时2次，结果不错，当然有的人可以从24一直收到72,这需要你自己摸索；6.是否需要超速离心浓缩病毒取决于你的目的，浓缩可以提高滴度，但步骤麻烦且需特别小心，不提倡初学者使用，我一般不经浓缩的病毒上清最后也能接近10的7次方左右，做绝大部分的实验已经绰绰有余了，一味盲目地追求滴度最终来可能两手空空；7.关于滴度的检测，比较精确的就是用不同稀释比例的病毒上清去感染（infection）293T/FT细胞（这个质粒需要带荧光标记），24-48小时上流式检测，再根据公式计算。说了这么多，都是自己做病毒1年多的一些心得体会，以求抛砖引玉，版上肯定还有很多高人，只是没有露面而已，祝你好运，呵呵！
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emerling6821
用户谢谢楼上的回复。我确实是在恶补分子生物学知识；另外，我所用的病毒颗粒是公司已构建好的，用于感染成纤维细胞，苦于不明白AmpR的具体作用。那么，根据楼上所说，我所有的目的基因过表达病毒颗粒不带有GFP，又无抗性基因，那就无法对感染后的细胞进行筛选了。
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aaron928
用户哎！汗啊~！你用来做transfection的plasmid怎么去amplify呢？还不是要先在菌里面扩起来嘛！没有荧光标记，又没有抗性基因，貌似是不好筛选。。。你自己就不会插一个进去啊？！这么简单的事情，两顿饭的功夫而已嘛！罚你，每晚上床之前，捧着分子克隆，面壁思过一小时！以后就不会再问这些问题了：）
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emerling6821
用户晕菜！！！我是说，病毒已包装构建好，公司做的。那我现在能做什么？越来越糊涂了。
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gongtj
用户lz，如果公司已帮你包装好病毒，那你可以直接拿去用了呗，感染目的细胞啊。
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erenren
用户就三张图谱啊？
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gladys1986
用户第一，你载体够好了，应该放在受体菌里面扩大，提取质粒。第二，那个amp是为了让你在原核里面扩增质粒时候用的抗性。第三，抽取好的质粒，就可以包装病毒了，需要荧光标记来检测转染情况，如果没有，需要对载体再进行改造。
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zx_0504
用户楼上说的很明白了。我再罗嗦几句。公司做好的质粒你回来要在原核中（E.coli）扩增备份的，否则几次就用完了啊！AmpR是为了让你在原核里面扩增质粒时候用的筛选抗性。扩增好留有备份后就可以转染目的细胞了。这时候需要有Neo,Puro或荧光表达进行筛选。这是两类不同目的的和用途的筛选。
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melodyzhm
用户楼主放在附件里的载体貌似和我刚刚构建好的病毒是一个系统！请问楼主是哪家公司构建的？看时间，2009，那么楼主现在实验做的如何？这个病毒系统怎么样？我正准备后天开始摸条件呢？有很多问题！！我觉得上面讨论的内容，大家重点不太相同，楼主估计是问，载体里面的AmpR是何作用，但其实他的病毒已经是成品啦，直接可以用来转染目的细胞，而下面回答的好像是关于构建病毒过程中的问题，楼上说的对，以我的理解，应该是：AmpR是在包装病毒过程中用来筛选的，而已经够好的病毒在转染目的细胞时没有抗性基因，也不能在大肠杆菌里扩增，但是有荧光GFP可以用来看转染率，若要筛选，可以用流式筛！不知道对不对哦，刚接触，还是菜鸟级！大家多多讨论！
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xiaoxin34999
用户好东西啊期待更完善更全面的过程，包括前期的工作和后期的应用，能举例就更好了
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xiaoxin34999
用户maker真的要好好咋么咋么，刚入道的新选手，莫怪
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0318_duyanyan
用户我也是做慢病毒，病毒已经让公司包好了，现在准备转染目的细胞，今天打算摸个MOI值，希望成功。
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0318_duyanyan
用户我也是新手，心里特别没底。
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0318_duyanyan
用户以后希望各位高手多多指点！
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chenghong4321
用户你们都是公司包的啊？大概多少费用啊？我已有病毒质粒，准备自己包，不知有没人做过？病毒上清液浓缩时用的过滤器啊过滤管啊什么的，是不是要特殊买的啊？求解。
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invabio
用户为了让客户体验我们公司的慢病毒产品，最近我公司推出了GFP/RFP慢病毒试用装的免费申请活动。活动详情请见丁香通试用中心有奖试用专区http://www.biomart.cn/info/try.htm，名额有限，先到先得。您也可直接与我公司联系，公司名称：上海英为信生物科技有限公司，咨询电话021-51507117-805。
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jjyx5
用户根据有关专家论证，慢病毒和腺相关病毒，将是未来最有前途的病毒载体
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xujian2004265
用户我们的滴度还挺高的，还和转染试剂的效率有关
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Emmanuelle
用户VSVGenvelop的病毒很容易做，titer会非常高，肯定107以上，也比较稳定，transfection基本可以达到100%的，楼上的照片很漂亮，不过细胞再多一点就好了，这样titer可以更理想
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xujian2004265
用户还有照片比这更好的
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20060806
用户各位前辈，我刚刚开始做慢病毒，想请教一下，一般病毒液感染目的细胞后多长时间可以看见荧光啊？目前我已经感染48小时了，只有个别细胞可以看到，大部分都看不到荧光
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BSZLY2003
用户目前我也在做慢病毒这块，公司包装的过表达慢病毒颗粒，按照以往的MOI值加的病毒，从感染后48小时到96小时每天都镜下观察荧光，感染率不到5%。可是对照空载组在48小时同样的MOI值下，荧光镜下感染率已经能达到80%，不知道问题出在哪里，我是怀疑公司给的滴度不够，请高手指点一二，最好能给个感染细胞的具体步骤。
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gangster2008
用户好像许多只是收集一次的上清
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keliny
用户BSZLY2003你好，我的实验也出现了和你类似的问题，慢病毒感染一种细胞时，空病毒的感染率也有90%以上，但含目的基因的病毒感染后只有百分之几，另外，感染目的细胞（鼻咽癌细胞）一周后两种病毒液感染后都未见荧光出现，想请教下问题可能在哪，希望帮忙解决下了，谢谢
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laoguaihb
用户慢病毒腺病毒群：182509118慢病毒腺病毒，干扰，过表达，细胞转染，细胞功能实验，动物实验………大家一起来相互学习相互讨论。
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bianyueyue
用户请问一下，我在包装慢病毒过程中发生了污染，会是什么原因导致的啊。谢谢。我是初学者
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zhanghao8
用户喜欢这样的帖子，给我们新手创造了很多财富，顶一个
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zrw11
用户mark
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293bbs
用户我用了很多年的病毒载体，各种病毒也包过非常多，欢迎大家来我的病毒包装与质粒转染精华答疑贴答疑，基本秒回复！贴子链接：腺相关病毒包装（AAV）、慢病毒包装、腺病毒包装、细胞转染、病毒在体转染【技术答疑】
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