PlasmidInfo:
PlasmidInformation
ProductName:pSF-CMV-Puro-NH2-6His-CAT-TEV
ProductCode:OG1347
Size(bp):6842bp
BacterialAntibioticSelection:KanR
OriginandCompatibility:pUChighcopyderivedfrompBR322
BacterialCopyNumber:500-700percell
Promoter:Cytomegalovirus(CMV)immediateearlypromoter/HumanUbiquitinPromoter
PlasmidPurpose:
Thisplasmidisdesignedtoexpresstaggedproteinsinmammaliancellseitherbytransienttransfectionorbycreatingstablecelllines.ItcontainsapuromycinresistanceexpressioncassetteusingthehumanUbiquitinpromotertodriveexpressionandallowfortheselectionofcellscontainingtheplasmid.
AbouttheCleavageTag:Thisplasmidalsoencodesaproteasecleavagesitethatisdesignedtobepositionedbetweenyourgeneofinterestandthetagtoallowtheremovalofthetagfollowingproteinpurificationorisolation.ThisplasmidcontainsaTEVcleavagetag.Theproteinsequenceofthecleavagetagis:ENLYFQG.CleavageoccursbetweentheGluandGlyresidues.TEVisoftenreportedtohavebetterspecificityforitsrecognitionsitecomparedtoEKTThrombinorFaxtorXa.
Formoreinformationonwhichcleavagetagtouseseeourcleavagetagguide.
PromoterExpressionLevel:ThisplasmidcontainsthemammalianCMVpromotertodrivegeneexpression.WehavetestedallofourmammalianpromotersinarangeofcelltypesandCMVisconsistentlythestrongestinthosewehavestudied.HowevertherearemanyreportsoftheCMVpromoterdemonstratingsilencingbymethylationinlong-termculture.ForthisreasonwestockarangeofotherpromotersthatarecompatIBLewiththisplasmidandareavailableonrequest.
Thisplasmidcontainsann-terminalChloramphenicolAcetylTransferase(CAT)reportertagthatcanbefusedtoageneofinteresttoallowproteindetection.
ThisplasmidalsocontainsasecondaryHexa-Histidine(6His)proteintag.Thesequenceofthistagis:HHHHHH
Weprovidearangeofdualpeptidetagplasmids.ThisisbecausesomepeptidetagsprovidespecificBIOLOGicalproperties(e.gsmallmoleculeaffinitynewepitopessolubilityorproteinsecretion)thatarenotprovidedbyothers.
SequenceandMap:
OtherInfo:
TranscriptionTermination:Thisplasmidcontainsthreealternativetranscriptionterminatorsformammalianbacterialandbacteriophage(T7)expression.Thismeansthatonlythepromoterneedstobechangedtoaltertheexpressionsystemyouareusing.Wesellmultiplepromotersthatcanbeusedineachofthesesystems.Thepresenceofeachterminatordoesnotreduceexpressioninthealternativesystems.
Cloning:
MakingProteinFusions:ThisplasmidhasbeendesignedtoallowthreetypesofcloningintothemainMCStojoinacodingsequencewiththetag.
1:SnapFusionCloning:IfyouwouldliketofuseyourcodingsequencetothetagwithminimaladditionalbasesyoucanuseourSnapFusiontechnology.ThisprocessinvolvesamplifyingyourgenebyPCRtoaddspecificrestrictionsitesontotheends.WhenthesesitesarecuttheyproduceanoverhangthatiscompatiblewiththisplasmidcutwithBseRIorBsgI.
Toinsertyourgene:
1:Amplifyyourgenewithprimersdesignedusingthisspreadsheet
2:CuttheplasmidwitheitherBseRIorBsgI.*
3:Cutyourgenewiththeenzymeyouaddedusingthespreadsheet(anyofAcuIBpmIBpuEIBseRIBsgIEciI).
4:ClonethegeneintotheplasmidusingDNAligase.
UsingthismethodwithanN-terminaltagplasmidwillresultinthetagcodingsequenceimmediatelyfollowedbyyourgenesATGstartcodonatthejoin.Thisresultsinaseamlessfusionofthetwosequenceswithnoextrabasesbeingadded.UsingthismethodonC-terminaltagplasmidswillconvertyourgenesstopcodonintoaTAC(TyrY)codonfollowedbytheplasmidtagcodingsequence.Thisresultsinnoextrabasesbetweenyourgeneandthetag.Seethediagrambelowformoreinformation.
*PleasenotethatinsectexpressionplasmidscannotbecutwithBsgIonlyBseRIbecauseofunavoidableconflictingsitesinthebackbone.AlsoYeastplasmidscannotbecutwithBseRIbecauseofunavoidablerestrictionsitesinthebackbone.
Usingthistechniquewillcreateagenefragmentthatcanbeligatedintoanyorour>1500peptideandreportertagplasmids.Ifyouuseoneoftheothertechniquesbelow(GibsonInFusionSeamlessorLIC)youwillneednewprimersforeveryvectoryoucloneintobecausethearmsofhomologywillchangeaccordingtothetagplasmidyouarecloninginto.
Ifyoufindthatyourgenesequencehassitesinitthatmakeusingthiscloningstrategydifficultyoucanstilluseoneofthealternativemethodsbelow(e.g.standardcloningorGibsoncloning).
OpenthePrimerDesignTooltohelpyoudesignprimersforcloningyourgeneinourSnapFusiontechnique.
2:StandardEnzymes:Ifyouarenotconcernedaboutleavingafewextrabasesbetweenthetagcodingsequenceandyourgeneyoucancloneyourgeneintothevectorusingstandardcloningrestrictionenzymes.Thisstrategywillrequireyoutochoosewhichenzymesyouwanttousetocloneyourgene.
OpenthePrimerDesignToolwhichprovidesprimerswithdifferentenzymechoicespositioningyourgeneasclosetothetagaspossibleineachcase.Pleasenotethatstandardenzymeswillalwaysleaveadditionalnucleotidesbetweenyourgeneandthetagbutusingthespreadsheetwillensurethetagandgeneareinframe.
3:Gibsoncloning/InfusionHD/GeneArtSeamless/LigaseIndependentCloning(LIC)Methods:ThesecloningtechniquesusereagentssoldbyothercompaniesandallowyoutofusesequencestogetherusingenzymesthatchewbacktheDNAtoleaveoverlappingends/overhangs.ThesubsequentmethodofjoiningtheDNAdependsonthekitused.Touseoneofthesetechniquesyoucaneitherdesignyourownprimersoryoucanusethespreadsheetbelowtohelpwiththedesign.
OpenthePrimerDesignTooltohelpyoudesignprimersforcloningyourgeneusingGibsonassemblyInfusionHDGeneArtSeamlesscloningorLigaseIndependentCloning(LIC)techniques.
IPStatus:
IntellectualPropertyStatusThisproductispartofourSnapFastplasmidrange,formoreinformationontheIntellectualpropertystatusofthisplasmidpleaseclickhere
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
2、基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用．（2）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
②启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始，故②正确；
③终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束，故③正确；
④由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，
早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源基因的读码框一致时,产生由内源蛋白的N 末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质 。近来对这一类载体所做的改进是在报告基因与SA 序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES ,这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES 细胞中大量基因具转录活性,为了获得全基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。因此,在第一、二代基因捕获载体中应用报告基因和含自身启动子( PGK) 的筛选标记基因neo ,抗药性的产生不需要捕获基因的表达。不同的是,第二代基因捕获载体中筛选标记基因3′末端没有polyA 加尾信号而含有一剪接供体序列 ,必须由内源基因提供polyA 加尾信号以产生稳定的筛选标记基因mRNA 而获得筛选克隆,因此与第一代载体相比,降低了基因间插入的背景。polyA 捕获载体还解决了第一代基因捕获载体突变基因信息鉴定的难题。3′- RACE 可用以鉴定polyA 捕获基因3′端编码序列或3′非翻译区(UTRs) 序列信息,对于基因鉴定比5′- UTRs 序列有用得多。用以克隆捕获特异类型蛋白编码基因的多种新型载体也已问世,如Skarnes 等利用分泌蛋白的原理及β-gal 活性在内质网被灭活的特点设计了一种载体专门用以捕获在ES 细胞中表达的编码穿膜分泌蛋白的基因 。一些研究小组还在载体中引入了重组位点,以实现由重组酶介导的捕获位点插入后修饰 。这种“敲进 ”的策略允许对捕获位点作进一步修饰,如“指派”捕获基因的启动子成分驱动敲入的转基因表达来进行“回复突变( rescue) ”或细胞标记实验;通过敲入含不同突变的捕获基因cDNA 还可产生等位基因系列;含lox 位点的载体还可实现在捕获基因组条件性取代载体产生更精细的突变,包括点突变和/ 或选择性表型标记,可以更好地控制突变的性质。向左转|向右转
各位大神，我现在用PET28α作为表达载体，在连接的时候是不是载体要进行双酶切、胶回收?我双酶切的目的片段和PET28α连接后，导入感受态中没有成功，不知道怎么回事，请教各位。
(forced expression)或过表达(overexpression),以观察基因表型,反义则是用来抑制基因表达,以观察在目的基因的表达受到抑制的情况下表型的变化
在生物体内发现主要有三种不同的RNA分子在基因的表达过程中起重要的作用。它们是信使RNA（messengerRNA，mRNA）、转运RNA（tranfer RNA，tRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）。RNA含有四种基本碱基，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外还有几十种稀有碱基。
RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3'，5'磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那样都是双螺旋结构，只有在许多区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要4～6对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。【RNA的二级结构】细胞内有三类主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。它们各有特点。在大多数细胞中RNA的含量比DNA多5～8倍。【大肠杆菌RNA的性质】
mRNA
生物的遗传信息主要贮存于DNA的碱基序列中，但DNA并不直接决定蛋白质的合成。而在真核细胞中，DNA主要贮存于细胞核中的染色体上，而蛋白质的合成场所存在于细胞质中的核糖体上，因此需要有一种中介物质，才能把DNA 上控制蛋白质合成的遗传信息传递给核糖体。现已证明，这种中介物质是一种特殊的RNA。这种RNA起着传递遗传信息的作用，因而称为信使RNA(messenger RNA，mRNA)。
mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，完成基因表达过程中的遗传信息传递过程。在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。因为这种未经加工的前体mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差别很大，所以通常称为不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA）。
tRNA
如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。但是，合成蛋白质的原材料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，必须用一种特殊的RNA——转运RNA（transfer RNA，tRNA）把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。每种氨基酸可与1-4种tRNA相结合，现在已知的tRNA的种类在40 种以上。
tRNA是分子最小的RNA，其分子量平均约为27000（25000-30000），由70到90个核苷酸组成。而且具有稀有碱基的特点，稀有碱基除假尿嘧啶核苷与次黄嘌呤核苷外，主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。这类稀有碱基一般是在转录后，经过特殊的修饰而成的。
1969年以来，研究了来自各种不同生物，:如酵母、大肠杆菌、小麦、鼠等十几种tRNA的结构，证明它们的碱基序列都能折叠成三叶草形二级结构（图3-23），而且都具有如下的共性：
① 5’末端具有G（大部分）或C。
② 3’末端都以ACC的顺序终结。
③ 有一个富有鸟嘌呤的环。
④ 有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。
⑤ 有一个胸腺嘧啶环。
rRNA
核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。
rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。S为沉降系数（sedimentation coefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。
rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。在双链区，碱基因氢键相连，表现为发夹式螺旋。
rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全明了。但16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这可能有助于mRNA与核糖体的结合。
snRNA
除了上述三种主要的RNA外，细胞内还有小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端体酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。
有的RNA分子还具有生物催化作用。
上述各种RNA分子均为转录的产物，mRNA最后翻译为蛋白质，而rRNA、tRNA及snRNA等并不携带翻译为蛋白质的信息，其终产物就是RNA。
2006诺贝尔医学奖成果RNA干扰机制解读
1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！科学界对此感到极度困惑。
类似的谜团，直到美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛发现RNA（核糖核酸）干扰机制才得到科学的解释。两位科学家也正是因为1998年做出的这一发现而荣获今年的诺贝尔生理学或医学奖。
根据法尔和梅洛的发现，科学家在矮牵牛花实验中所观察到的奇怪现象，其实是因为生物体内某种特定基因“沉默”了。导致基因“沉默”的机制就是RNA干扰机制。
此前，RNA分子只是被当作从DNA（脱氧核糖核酸）到蛋白质的“中间人”、将遗传信息从“蓝图”传到“工人”手中的“信使”。但法尔和梅洛的研究让人们认识到，RNA作用不可小视，它可以使特定基因开启、关闭、更活跃或更不活跃，从而影响生物的体型和发育等。
诺贝尔奖评审委员会在评价法尔和梅洛的研究成果时说：“他们的发现能解释许多令人困惑、相互矛盾的实验观察结果，并揭示了控制遗传信息流动的自然机制。这开启了一个新的研究领域。”
科学家认为，RNA干扰技术不仅是研究基因功能的一种强大工具，不久的未来，这种技术也许能用来直接从源头上让致病基因“沉默”，以治疗癌症甚至艾滋病，在农业上也将大有可为。从这个角度来说，“沉默”真的是金。美国哈佛医学院研究人员已用动物实验表明，利用RNA干扰技术可治愈实验鼠的肝炎。
目前，尽管尚有一些难题阻碍着RNA干扰技术的发展，但科学界普遍对这一新兴的生物工程技术寄予厚望。这也是诺贝尔奖评审委员会为什么不坚持研究成果要经过数十年实践验证的“惯例”，而破格为法尔和梅洛颁奖的原因之一。
诺贝尔生理学或医学奖评审委员会主席戈兰·汉松说：“我们为一种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的科学家证明是正确的，是给它发个诺贝尔奖的时候了。”
补充
核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。
RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基。
与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。
在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA）, rRNA（核糖体RNA）, mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
在病毒方面，很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体（有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体）。
1982年以来，研究表明，不少RNA，如I、II型内含子，RNase P，HDV，核糖体大亚基RNA等等有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶（ribozyme）。
20世纪90年代以来，又发现了RNAi（RNA interference，RNA干扰）等等现象，证明RNA在基因表达调控中起到重要作用。
在RNA病毒中，RNA是遗传物质，植物病毒总是含RNA。近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子，叫做类病毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子，此外，真核细胞中还有两类RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前体；snRNA参与hnRNA的剪接（一种加工过程）。自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基序列确定以后，RNA序列测定方法不断得到改进。目前除多种tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等较小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测定已完成，如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。
我现在手上有PMD2.G与PSPAX2两个载体，求推荐与其配套的慢病毒过表达载体，谢谢。
翻译结果：
Alpha stable transfection hif - 1 RNA interference expression vector
稳定转染hif-1α rna干扰表达载体_有道翻译
翻译结果：
Alpha stable transfection hif - 1 RNA interference expression vector
当然，确定miRNA与mRNA之间的互作，我们还有更直接的方法，那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗体进行免疫共沉淀（co-IP）。生物通 www.ebiotrade.com
目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。
Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。生物通
整个过程大致如下：
1. 创建miRNA模拟物。生物通 www.ebiotrade.com
2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞，并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。
3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。生物通 www.ebiotrade.com
4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物（其中包括靶标mRNA）进行免疫沉淀。
5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。
6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA，鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。
Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文库让研究人员能够在实验室内开展全转录组范围的miRNA和ncRNA靶基因鉴定。它是个全转录组范围的cDNA文库。在文库转染和选择之后，细胞被已知miRNA转染。对于那些包含与miRNA相互作用的cDNA的细胞，它们将生存到第二轮。那些选择出的cDNA可通过测序来鉴定。这样，研究人员只需投入很少，就能实现大范围的筛选。
靶基因的验证
预测终归是预测，miRNA的靶基因还必须经过验证。这个过程与一开始寻找靶基因的过程相似，也就是抑制或过表达miRNA，然后检查mRNA或蛋白水平的反应。生物通 www.ebiotrade.com
目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法。首先，构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR插入荧光素酶基因的3’UTR中，然后将构建好的重组载体转染到细胞中，并改变miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况，以分析3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。
目前有多家公司提供荧光素酶报告载体或构建服务。Promega就提供pmirGLO双荧光素酶表达载体。它采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶这两种报告基因，其中萤火虫荧光素酶（luc2）作为主要报告基因，其表达减少意味着内源性的或外源引入的miRNA 与克隆的miRNA 的靶序列发生了结合；海肾荧光素酶/新霉素基因（hRluc-neo）作为对照报告基因，既能实现归一化处理，又能筛选稳定转染的细胞系。这样就以一个载体实现了以往两个载体的功能。
就目前而言，预测和鉴定miRNA靶基因的方法虽然不少，但仍然没有一种常规方法。随着计算机算法的不断改进和生物学技术的快速发展，这种现状有望改变。让我们拭目以待吧。（生物通 余亮）
2、人体病灶细胞或者分泌型细胞有载体病毒受体；
3、DNA病毒，且酶切改造后具有复制能力；
4、表达产物对载体病毒没有抑制作用。
不知道是否准确，希望对你有帮助。
暂无品牌分类
