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NEB/pSV40-CLuc Control Plasmid/N0318S/20 μg
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Description:
ThepSV40-CLucControlPlasmidisamammalianexpressionvectorthatencodesthesecretedluciferasefromtheOstracodCypridinanoctiluca(1)asareporter,underthecontroloftheconstitutiveSV40promoter.CypridinaLuciferase(CLuc)isa62kDaproteinwithanativesignalpeptideattheN-terminusthatallowsittobesecretedfrommammaliancells(1)sothatCLucactivitycanbedetectedintheculturemedium.Thereisamultiplecloningsite(MCS)upstreamoftheSV40promoter.RecommendedsequencingprimersforpSV40-CLuc:
Forwardprimer(23-mer)(notavailablefromNEB)
5´-GAGTTCAAGAAAGAATGCTACAT-3´(1888–1910)
Reverseprimer(24-mer)(notavailablefromNEB)
5´-GTAAGGACAGTCCTGGCAATGAAC-3´(360–337)
DNASUandAddgenearecentralrepositoriesforplasmidclonesandcollectionsthatmayalsobehelpful.
Highlights
- PolylinkerMCS:1–51
- SV40promoter:51-246
- CLucORF:291–1952
- StartcodonofCLuc:291–293 Stopcodon:1950–1952
- Signalpeptide:291–344
- SV40poly-Asite:1967–2188
- SV40enhancer:2195–2441
- Bacterialreplicationori(pMB1):3347–2759
- Ampresistance:4378–3518
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2018-06-12
基因治疗药物研发概况 基因治疗是二十世纪九十年代发展起来的一种全新的疾病治疗模式，是通过载体将外源基因导入靶细胞，以纠正或改善致病基因所产生的缺陷，达到治疗疾病的目 查看更多
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2021-08-07
维普期中文期刊服务平台,由维普资讯有限公司出品,通过对国内出版发行的14000余种科技期刊、5600万篇期刊全文进行内容分析和引文分析,为专业用户提供一站式文献服务... 查看更多
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2017-10-13
上海吉凯基因化学技术有限公司在发布的Easy-shRNA质粒载体产品供应信息，浏览与Easy-shRNA质粒载体产品相关的产品或在搜索更多与Easy-shRNA质粒载体产品相关的内容。 查看更多
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载体（vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。... 查看更多
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2018-05-21
pEGFP-N1 哺乳动物表达载体是由北京索莱宝科技有限公司代理或销售的solarbio品牌的试剂，产品来源于北京市通州区马驹桥联东U谷85A三层。北京索莱宝科技有限公司是中国最权威的pEGFP-N1 哺乳动物表达载体试剂销售服务商之一，在北京等地方销售pEGFP-N1 哺乳动物表达载体试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业pEGFP-N1 哺乳动物表达载体仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的pEGFP-N1 哺乳动物表达载体产品 查看更多
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2018-12-25
For amplification of cognate sequences from different organisms, or for "evolutionary PCR", one may increase the chances of getting product by designing 查看更多
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2021-09-16
上海沪震实业有限公司在发布的载体HDM-Tat1b供应信息，浏览与载体HDM-Tat1b相关的产品或在搜索更多与载体HDM-Tat1b相关的内容。 查看更多
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2021-07-20
PiggyBacDualpromoter(PB513B-1)载体转座子载体系统是由深圳市伟通生物公司代理或销售的SBI品牌的试剂，产品来源于国外。深圳市伟通生物公司是中国最权威的PiggyBacDualpromoter(PB513B-1)载体转座子载体系统试剂销售服务商之一，在深圳等地方销售PiggyBacDualpromoter(PB513B-1)载体转座子载体系统试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业PiggyBacDualpromoter(PB513B-1)载体转座子 查看更多
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2017-11-25
2018-08-08
本章将会讨论昆虫来源的杆状病毒展示载体的设计及其潜在的用途。建立展示库的一般步骤和这些基因递送载体的特性也将会在本章中进行阐述。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」 查看更多
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2021-07-18
上海酶研生物科技有限公司在发布的载体pCAMBIA1381供应信息，浏览与载体pCAMBIA1381相关的产品或在搜索更多与载体pCAMBIA1381相关的内容。 查看更多
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2021-07-16
北京五加和分子医学研究所有限公司在发布的慢病毒载体服务供应信息，浏览与慢病毒载体服务相关的产品或在搜索更多与慢病毒载体服务相关的内容。 查看更多
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【求助】pEGFPN1载体的问题 急啊123
贫乳圆香☆1032017-11-10
与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点：
①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；
②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；
③蛋白本身性质稳定；
④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；
⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。
pEGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。pEGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。
pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因，如上图质粒图谱所示。
pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：
①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；
②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；
③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；
④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。向左转|向右转
①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；
②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；
③蛋白本身性质稳定；
④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；
⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。
pEGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。pEGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。
pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因，如上图质粒图谱所示。
pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：
①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；
②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；
③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；
④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。向左转|向右转
基因捕获技术的现状及应用123
落帅2102017-11-06
基因捕获载体在基因组中也有“hot”和“cold”插入位点。但是计算机模拟显示,按照单个克隆被捕获的百分比,如果以多种类型的载体进行足够多次的突变实验所获得的突变克隆就可以覆盖整个ES细胞基因组中全部基因位点 。因此,新型捕获策略和载体不断被设计应用。
早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源基因的读码框一致时,产生由内源蛋白的N 末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质 。近来对这一类载体所做的改进是在报告基因与SA 序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES ,这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES 细胞中大量基因具转录活性,为了获得全基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。因此,在第一、二代基因捕获载体中应用报告基因和含自身启动子( PGK) 的筛选标记基因neo ,抗药性的产生不需要捕获基因的表达。不同的是,第二代基因捕获载体中筛选标记基因3′末端没有polyA 加尾信号而含有一剪接供体序列 ,必须由内源基因提供polyA 加尾信号以产生稳定的筛选标记基因mRNA 而获得筛选克隆,因此与第一代载体相比,降低了基因间插入的背景。polyA 捕获载体还解决了第一代基因捕获载体突变基因信息鉴定的难题。3′- RACE 可用以鉴定polyA 捕获基因3′端编码序列或3′非翻译区(UTRs) 序列信息,对于基因鉴定比5′- UTRs 序列有用得多。用以克隆捕获特异类型蛋白编码基因的多种新型载体也已问世,如Skarnes 等利用分泌蛋白的原理及β-gal 活性在内质网被灭活的特点设计了一种载体专门用以捕获在ES 细胞中表达的编码穿膜分泌蛋白的基因 。一些研究小组还在载体中引入了重组位点,以实现由重组酶介导的捕获位点插入后修饰 。这种“敲进 ”的策略允许对捕获位点作进一步修饰,如“指派”捕获基因的启动子成分驱动敲入的转基因表达来进行“回复突变( rescue) ”或细胞标记实验;通过敲入含不同突变的捕获基因cDNA 还可产生等位基因系列;含lox 位点的载体还可实现在捕获基因组条件性取代载体产生更精细的突变,包括点突变和/ 或选择性表型标记,可以更好地控制突变的性质。向左转|向右转
早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源基因的读码框一致时,产生由内源蛋白的N 末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质 。近来对这一类载体所做的改进是在报告基因与SA 序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES ,这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES 细胞中大量基因具转录活性,为了获得全基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。因此,在第一、二代基因捕获载体中应用报告基因和含自身启动子( PGK) 的筛选标记基因neo ,抗药性的产生不需要捕获基因的表达。不同的是,第二代基因捕获载体中筛选标记基因3′末端没有polyA 加尾信号而含有一剪接供体序列 ,必须由内源基因提供polyA 加尾信号以产生稳定的筛选标记基因mRNA 而获得筛选克隆,因此与第一代载体相比,降低了基因间插入的背景。polyA 捕获载体还解决了第一代基因捕获载体突变基因信息鉴定的难题。3′- RACE 可用以鉴定polyA 捕获基因3′端编码序列或3′非翻译区(UTRs) 序列信息,对于基因鉴定比5′- UTRs 序列有用得多。用以克隆捕获特异类型蛋白编码基因的多种新型载体也已问世,如Skarnes 等利用分泌蛋白的原理及β-gal 活性在内质网被灭活的特点设计了一种载体专门用以捕获在ES 细胞中表达的编码穿膜分泌蛋白的基因 。一些研究小组还在载体中引入了重组位点,以实现由重组酶介导的捕获位点插入后修饰 。这种“敲进 ”的策略允许对捕获位点作进一步修饰,如“指派”捕获基因的启动子成分驱动敲入的转基因表达来进行“回复突变( rescue) ”或细胞标记实验;通过敲入含不同突变的捕获基因cDNA 还可产生等位基因系列;含lox 位点的载体还可实现在捕获基因组条件性取代载体产生更精细的突变,包括点突变和/ 或选择性表型标记,可以更好地控制突变的性质。向左转|向右转
RNA干扰的详细实验步骤_实验方法_123
小森尔2017-11-07
siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。RNA干扰主体实验的重点在于： 按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：⒈转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）
何为反义技术和rnai干扰技术123
49M25Sunny3582017-11-07
rnai
RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。
RNAi的定义
目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。
如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。
各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。
原理
最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。
这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。
有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1 RNA（11）转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。
另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。
RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验（17）。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。
上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。
总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。
应用
siRNA可用于研究基因的功能，可是后基因组时代的今天，研究人员已经不满足于一个一个基因沉默这样的研究节奏了，功能基因组学的研究更需要一个能站在全局高度研究多个基因之间关系的工具，因此，用作大规模RNA干扰用的shRNA/siRNA文库应运而生。 shRNA/siRNA文库联合使用高通量筛选技术和高内涵图像分析技术，使得RNAi筛选在反向基因组学、功能基因研究、药物发现等多个领域成为了一个 强大的应用工具。
北京赛诺亚生物技术有限责任公司（http://www.sirnoa.com/）是一家拥有独立自主产权的、以RNAi筛选的相关产品和技术服务为重点生物高新技术企业。公司专业从事各种高通量miRNA检测、RNA干扰筛选、药物筛选、文库筛选及相关产品的研发和销售，同时提供进行各种RNAi相关的载体构建、病毒包装 服务和细胞生物学试剂。公司致力于为从事生命科学研究和早期药物研发的科研人员提供一站式的RNA干扰相关服务。
总结
经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。
RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。
RNAi的定义
目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。
如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。
各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。
原理
最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。
这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。
有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1 RNA（11）转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。
另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。
RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验（17）。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。
上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。
总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。
应用
siRNA可用于研究基因的功能，可是后基因组时代的今天，研究人员已经不满足于一个一个基因沉默这样的研究节奏了，功能基因组学的研究更需要一个能站在全局高度研究多个基因之间关系的工具，因此，用作大规模RNA干扰用的shRNA/siRNA文库应运而生。 shRNA/siRNA文库联合使用高通量筛选技术和高内涵图像分析技术，使得RNAi筛选在反向基因组学、功能基因研究、药物发现等多个领域成为了一个 强大的应用工具。
北京赛诺亚生物技术有限责任公司（http://www.sirnoa.com/）是一家拥有独立自主产权的、以RNAi筛选的相关产品和技术服务为重点生物高新技术企业。公司专业从事各种高通量miRNA检测、RNA干扰筛选、药物筛选、文库筛选及相关产品的研发和销售，同时提供进行各种RNAi相关的载体构建、病毒包装 服务和细胞生物学试剂。公司致力于为从事生命科学研究和早期药物研发的科研人员提供一站式的RNA干扰相关服务。
总结
经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。
【求助】基因敲除载体,克隆载体,表达载体,报告载体的区别? 核酸...123
从此天天向上2014-04-07
上次听讲座说基因敲除小鼠模型的载体构建时不能加抗性基因，不懂为什么，而我看了很多相关书籍都有用抗性筛选，不懂为什么，请指教？
慢病毒载体的启动子报告基因 核酸基因技术讨论版论坛123
feifei832021-08-24
请教一下，一般做启动子报告基因检测，载体用pGL3,pGL4双荧光报告基因质粒，但pGL3,pGL4都只能做瞬时转染，我的细胞（不想用293做实验）质粒转染后都会死很多，还要加上一些处理因素（比如药物，饥饿等），细胞状态更不好了。所以想找一个慢病毒骨架的报告基因质粒。
上网查了下，SBI的pGreenFire1和Genecopia的Gluc-ON是慢病毒质粒。
1.pGreenFire1可以检测Luc和GFP，但用什么做内参呢？查了下文章，有的文章检测Luc的时候同时检测一个MTS读数做内参；另外有一篇文章用qPCR的方法检测了GFP和GAPDH，用GAPDH做内参。不确定这样是不是正确呢？
2.Gluc-ON检测的是分泌型的Gluc，载体上还有分泌型的碱性磷酸酶做内参。
不知有没有哪位以前用过这两个质粒的？文章用这两个质粒的都不多，不知投稿的时候会不会被质疑？
GUS报告基因123
唯爱一萌4493042021-09-06
如何利用GUS报告基因检测所需基因
标记基因通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。
如：某种具有氨苄抗性基因质粒（该基因即可认为标记基因），与外源DNA片段组合形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有氨苄抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。当用选择培养基（比如含有氨苄的培养基），来培养受体细胞时，能够在培养基中存活下来的受体细胞就可以认为是成功的导入了外源DNA，标记基因就起作用了。
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。
如：
绿色荧光蛋白(gfp)基因。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生光，GFP
Cdnad开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。
标记基因通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。
如：某种具有氨苄抗性基因质粒（该基因即可认为标记基因），与外源DNA片段组合形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有氨苄抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。当用选择培养基（比如含有氨苄的培养基），来培养受体细胞时，能够在培养基中存活下来的受体细胞就可以认为是成功的导入了外源DNA，标记基因就起作用了。
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。
如：
绿色荧光蛋白(gfp)基因。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生光，GFP
Cdnad开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。
20162017年慢病毒感染目的细胞123
emerling68212009-07-03
用三质粒系统构建慢病毒颗粒，如附件；
问题
1AmpR是在筛选阳性质粒时发挥作用；
2氨卞青霉素只对原核生物起作用；
3在病毒颗粒感染目的细胞后，AmpR并未在目的细胞中表达（或者说没整合入目的细胞基因组）
4如果有整合入目的细胞基因组，那么可以起到药物筛选的作用吗？
慢病毒系统构建.doc(182.0k)
问题
1AmpR是在筛选阳性质粒时发挥作用；
2氨卞青霉素只对原核生物起作用；
3在病毒颗粒感染目的细胞后，AmpR并未在目的细胞中表达（或者说没整合入目的细胞基因组）
4如果有整合入目的细胞基因组，那么可以起到药物筛选的作用吗？
慢病毒系统构建.doc(182.0k)
病毒怎么研发的（世界第一支病毒载体的基因治疗抗肿瘤药物是由哪个...123
2017-11-06
世界上第一支病毒载体的基因治疗抗肿瘤药物是由哪个公司研发生产的
一种新型双荧光素酶报告基因表达载体的构建123
逗比2号2021-09-18
【交流】请教一个有关报告基因的启动子载体构建问题!_问答详情_...123
不言佳士2021-09-19
各位战友，请教一下问题，就是大家在构建报告基因的启动子区时，是如何选定启动子区的长度呢？
第二个问题是不是构建的启动子区均要有一个TATA盒的结构在里面，不然构建的启动子如何就能驱动LUC的表达呢？
第三个问题是，如果我们在构建时长度延至ATG之后100－200BP的启动子是否会影响LUC的表达呢？
谢谢！
第二个问题是不是构建的启动子区均要有一个TATA盒的结构在里面，不然构建的启动子如何就能驱动LUC的表达呢？
第三个问题是，如果我们在构建时长度延至ATG之后100－200BP的启动子是否会影响LUC的表达呢？
谢谢！
【求助】有关慢病毒的几个问题123
WFy19912021-08-08
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