重组展示病毒滴度的检测

材料

试剂

抗体

羊抗鼠辣根过氧化物酶（HRP)标记的二抗

使用前按1:4〇〇用PBS-Tween稀释。

鼠源性抗_gp64抗体

使用前用PBS-T稀释。

杆状病毒.

蓝辣根过氧化物酶底物

乙醇

固定剂（fonny卜bufferedacetone)

30%PBS

45%丙酮

25%福尔马林（稀释自37%的甲醛

每片500ul,根据需要固定的量在使用前配制。

盐酸

去离子水

无血清昆虫细胞培养基（如HyQSFX[HyClone],InsectXpress[Biowhittaker],或S/-900IISFM[Invitrogen])

甲基纤维素（〇.6%m/VO溶于昆虫细胞培养基

高温灭菌甲基纤维素，再加人培养基，搅拌过夜。

封片液（如Mowiol;CalWochem)

正常山羊血清（NGS)

使用前用PBS-Tween以1:30比例稀释。

PBS/Tween(PBS-T,0.05%Tween20)

磷酸盐缓冲液（PBS)

Spodopterafrugiperda（Sf9)细胞株（ATCC,CRL-1711)

仪器

显微镜载玻片（12孔；如Cel-line)

方法

1.将载玻片放人70%乙醇和1%HCl的溶液中浸泡过夜。自来水冲洗10次，去离子水冲洗3次，80°C孵育过夜。

2.收集对数生长期的S/9细胞，使其密度在1.5XIO⁶个/ml。

3.向载玻片的每个孔加入304Sf9细胞。置于增湿孵化器，28°C孵育30〜6〇min，让细胞附着于载玻片上。

4•用培养基稀释杆状病毒

10^-5、10^-6和10^-7最终稀释已经足够用于滴度检测。

5.小心地将培养基从培养细胞上移去，每孔接种IOul杆状病毒。每个稀释浓度4个孔，并且再做一个复本（如每个样品做两个片）。

6.增湿孵化器内28°C孵育lh。

7•除去接种物，每孔加入40fxl甲基纤维素。

8.用潮湿的纸巾包裹好载玻片放人塑料袋中密封，28°C孵育2〜3d。

9.每孔加入4CV1固定剂。室温孵育5〜lOmin。

不要过度固定，除去甲基纤维素也是没有必要的。

10.除去固定剂，用PBS^Tween洗涤载玻片3次，每次5min。

11.除去PBS-Tween，每孔加入稀释的NGS，室温孵育5min。

12.除去NGS，每孔加入15fxl鼠源抗gP64抗体，室温孵育30min。

13.除去一抗，EBS^Tween洗涤2次，每次5min。

14•除去PBS——Tween，每孔加人15jul稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温孵育25min0

15.除去二抗，PB^Tween洗涤3次，每次5min。

16.每孔加入15pl过氧化酶底物，显色1〜3h。

17•吸走底物，让载玻片风干。

18.将干燥后的样品封片。

干燥的载玻片通常能够在黑暗环境下保存1〜2周。

19.用光学纤维镜对孔内的染色焦点（4〜30个被染色的细胞形成的不连续的细胞簇）计数，每个孔有5〜25个焦点。

20.对于每个稀释浓度，确定每个孔染色焦点数的平均值。

21.用焦点的平均数乘以相应的稀释因子和接种正常化因子100,得到病毒滴度
病毒滴度（pfu/ml)=每孔中焦点的平均数Xl/稀释因子X100。