Description:
ChemicallycompetentE.coliBcellsengineeredtoformproteinscontaining disulfidebonds inthecytoplasm.
Highlights
- Transformationefficiency:1x107cfu/µgpUC19DNA
- EngineeredE.coliBstraintopromotedisulfidebondformationinthecytoplasm
- ConstitutivelyexpressesachromosomalcopyofthedisulfidebondisomeraseDsbC
- DsbCpromotesthecorrectionofmis-oxidizedproteinsintotheircorrectform(1,3)
- ThecytoplasmicDsbCisalsoachaperonethatcanassistinthefoldingofproteinsthatdonotrequiredisulfidebonds(4)
- EnhancedBL21derivative
- ActivityofnonspecificendonucleaseI(endA1)eliminatedforhighestqualityplasmidpreparations
- DeficientinproteasesLonandOmpT
- ResistancetophageT1(fhuA2),Nit,Spec,Str*
*Resistancetolowlevelsofstreptomycinmaybeobserved.
Genotype
fhuA2[lon]ompTahpCgalλatt::pNEB3-r1-cDsbC(SpecR,lacIq)ΔtrxBsulA11R(mcr-73::miniTn10--TetS)2[dcm]R(zgb-210::Tn10--TetS)endA1Δgor∆(mcrC-mrr)114::IS10Notes:
STORAGEANDHANDLING:Competentcellsshouldbestoredat-80°C.Storageat-20°Cwillresultinasignificantdecreaseintransformationefficiency.Cellsloseefficiencywhenevertheyarewarmedabove-80°C,eveniftheydonotthaw.ebiomall.com
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pCAMBIA2300特点：
大肠杆菌筛选抗性：卡那霉素。
植物筛选抗性：卡那霉素。
RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。
RNAi的定义
目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。
如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。
各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。
原理
最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。
这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。
有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1 RNA（11）转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。
另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。
RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验（17）。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。
上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。
总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。
应用
siRNA可用于研究基因的功能，可是后基因组时代的今天，研究人员已经不满足于一个一个基因沉默这样的研究节奏了，功能基因组学的研究更需要一个能站在全局高度研究多个基因之间关系的工具，因此，用作大规模RNA干扰用的shRNA/siRNA文库应运而生。 shRNA/siRNA文库联合使用高通量筛选技术和高内涵图像分析技术，使得RNAi筛选在反向基因组学、功能基因研究、药物发现等多个领域成为了一个 强大的应用工具。
北京赛诺亚生物技术有限责任公司（http://www.sirnoa.com/）是一家拥有独立自主产权的、以RNAi筛选的相关产品和技术服务为重点生物高新技术企业。公司专业从事各种高通量miRNA检测、RNA干扰筛选、药物筛选、文库筛选及相关产品的研发和销售，同时提供进行各种RNAi相关的载体构建、病毒包装 服务和细胞生物学试剂。公司致力于为从事生命科学研究和早期药物研发的科研人员提供一站式的RNA干扰相关服务。
总结
经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。
首先，给大家先分享一下有关细胞的基本知识。
细胞培养过程中绝对避免如细菌，支原体，真菌的污染，这些污染将显著地影响并改变实验结果。细胞培养因组织来源的不同而异，动物细胞一般采用黏附培养或者悬浮培养。根据其增殖潜力不同而被分为三类：原代细胞，细胞株，细胞系。
贴壁细胞：黏附细胞需要附着后才能生长，不断增殖的细胞在细胞培养器皿上铺成单细胞层。许多细胞在铺满细胞培养器壁后就不再增殖，有些细胞在此之后会死亡。从组织中得到的大多数细胞都是贴壁细胞。
悬浮细胞：悬浮细胞在培养基中存活和增殖，不需要黏附在细胞培养器皿上，包括造血干细胞（来源于血液，骨髓，脾脏），一些转化的细胞系以及恶性肿瘤细胞等。
原代细胞：由酶法、化学法或者机械法得到的组织碎片中的细胞迁移到细胞培养皿上形成了原代细胞，这些细胞在分散组织的过程中幸存下来，黏附或者悬浮于细胞培养液中，之后进行增殖。这些细胞不能或者仅能进行有限的细胞分裂，分裂相结束后进行衰老相，最后死亡。黏附原代培养细胞对接触抑制特别敏感，一旦铺满细胞培养皿他们就停止生长。培养原代细胞通常比培养细胞系更加困难。在实验中有时需要用到原代细胞而不是细胞系。
细胞株：从原代细胞开始的头几次传代所得到的细胞被称为细胞株。这些细胞传代几次后就衰老了，但可以导入病毒的转化因子增加细胞株的增殖代数。这些细胞的表型介于细胞株和细胞系之间，他们可以更长时间的增殖，但最终他们和细胞株一样也会衰老，停止分裂。在筛选稳定转化的细胞克隆时，使用这些细胞比原代细胞更方便。
细胞系：细胞株最终都会死亡，但他们中的某些个体发生了一些可稳定遗传的突变，这些突变使得这些细胞能够无限的增殖。这类细胞和它的后代被称为细胞系，这个过程被称为体外转化或永生化，这和体内的细胞癌变相似。无论是自发还是经过某种诱变剂的诱导，龋齿类动物的原代细胞会更容易形成细胞系。相比较而言，人的原代细胞很少会形成细胞系，但是从人癌组织中分离得到的细胞通常是永生的，可以传代成细胞系。细胞系比原代细胞和细胞株更易于使用。
下面简单先提几个问题：
问题：细胞污染问题解决（操作注意事项和污染源分析）
小编回复：
安全操作须知：操作所有可能具有感染性的材料应当遵循以下原则：操作细胞时严格按照细胞操作规程以最大可能避免操作者和细胞中可能带有的致病因子接触，操作细胞应当在合格的层流超净台中进行，注意无菌并且避免气溶胶的生成。操作完成后，所产生的废弃物应当用湿热灭菌或浸没在合适的去感染物溶液中。
无菌操作和尽量避免气溶胶产生所用的器械和溶液应该事先经过彻底灭菌，工作之前用消毒液擦拭台面，试剂瓶和手。操作过程避免形成气溶胶，吸入气溶胶是有害的。气溶胶也有可能会导致细胞之间的交叉污染。因此，应选用TD（todeliver）吸管而不是TC（tocontain）吸管，所用的吸管后端应该塞上棉花。混合溶液时避免快速的吸上吸下，吹出的液体时不要用力过猛。移液时移液管口尽量与培养瓶中液面接近。使用离心机时确保离心管盖是合上的，避免液滴残留在离心管盖附近。使用带盖的离心转头时，运行前务必盖紧。
使用层流超净台：保证层流超净台放置地方的气流不被经常搅动。避免把它安置在门口，通气口或经常有人活动的地方。超净台应放在专门的细胞培养间内。保持超净台的整洁，不把东西堆放在里面。工作之前，给工作台面和试剂瓶外表面消毒，把所有细胞操作作用到的东西都放在超净台内。有序排列器械，吸管，试剂瓶和垃圾杯，把用过的物品和干净的物品分开摆放。移动废物品时避免从干净的物品上经过。
细胞污染：细胞污染物会抑制细胞的生长，导致细胞死亡，使实验结果不一致。无论是细胞培养新手还是老手都会出现这样的问题。可以导致污染的途径举不胜举，例如不规范的操作，被污染的培养基，试剂，器械（如枪头），或是携带在操作者身上和来自其他实验室中的微生物。在动物细胞培养中，细菌，真菌，霉菌，支原体和其他种类细胞是常见的污染物。规范的操作可以帮助避免细胞被微生物和其他种类的细胞污染。为了减少偶尔细胞污染所造成的损失，我们建议冻存细胞保种，即使细胞被污染了也能够及时补充新的细胞。
微生物污染：细胞微生物污染后，有些情况下细胞培养基会变浑浊，pH值发生显著变化（通常为细菌污染）。另一些情况下，微生物污染不会使细胞培养液变浑浊，对细胞也不会产生明显的影响。例如支原体污染是一种极为常见，但极难检测到的微生物污染。
支原体污染-检测：支原体是一些体型小，生长缓慢的原核生物，它们没有细胞壁，是常见的细胞污染微生物。常用的抗生素和抗真菌药一般对支原体都没有作用。更糟糕的是，由于支原体一般不会比细胞生长更快也就不会引起细胞培养基的浑浊度和颜色变化，所以它们会长时间存在而不被发现，并会迅速传播到其他细胞中去。支原体污染会抑制细胞的代谢和生长，也会干扰细胞的核酸代谢和细胞的抗原性。急性的支原体感染会使所有的细胞状态变坏，有时候有个别细胞会形成克隆。有三种主要的检测支原体的方法：Hoeschest33258染色；支原体特异的DNA探针（FisherScientifie）；基于PCR的方法（如MinervaBiolabs的VenorGeMMycoplasmaDetectionKit）。另外，ATCC和MicroBIOLOGicalAssociates都提供付费的基于PCR的支原体检测服务。
支原体污染-清除：处理支原体慢性污染的细胞最明智的方法是丢弃它，用湿热灭菌或焚烧彻底消灭污染物。处理的方法主要是用各种商业化的抗生素处理，如Mynox®MycoplasmaEliminationReagent（MinervaBiolabs），enrofloxacin（Baytril®），及tiamulin和minocycline的混合处理（BM-Cyclin）。
细胞的交叉污染：细胞被另一种快速生长的细胞污染是较为严重的问题。为避免交叉污染，需要向可以保证质量的细胞库订购细胞，在超净台中一次只处理一种细胞，给不同的细胞分别准备所需的枪头，试剂，培养基。并且定期检查细胞的形态和生长特征。
请教一下，一般做启动子报告基因检测，载体用pGL3,pGL4双荧光报告基因质粒，但pGL3,pGL4都只能做瞬时转染，我的细胞（不想用293做实验）质粒转染后都会死很多，还要加上一些处理因素（比如药物，饥饿等），细胞状态更不好了。所以想找一个慢病毒骨架的报告基因质粒。
上网查了下，SBI的pGreenFire1和Genecopia的Gluc-ON是慢病毒质粒。
1.pGreenFire1可以检测Luc和GFP，但用什么做内参呢？查了下文章，有的文章检测Luc的时候同时检测一个MTS读数做内参；另外有一篇文章用qPCR的方法检测了GFP和GAPDH，用GAPDH做内参。不确定这样是不是正确呢？
2.Gluc-ON检测的是分泌型的Gluc，载体上还有分泌型的碱性磷酸酶做内参。
不知有没有哪位以前用过这两个质粒的？文章用这两个质粒的都不多，不知投稿的时候会不会被质疑？
①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；
②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；
③蛋白本身性质稳定；
④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；
⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。
pEGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。pEGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。
pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因，如上图质粒图谱所示。
pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：
①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；
②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；
③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；
④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。向左转|向右转
