蚂蚁淘的创始人兼CEO是钟定松先生，具有十年的从业经验，在业界享有良好的口碑； Ebiomall是跨境直采平台，我们直接从厂家采购，自己的团队负责国际物流和清关，中间没有第三方，蚂蚁淘承诺所售产品仅为正品，假一罚十。

未确认状态的订单可以修改，打开“订单详情”页面，点击右上角的“修改订单”即可，若已审核确定，则订单无法修改。

现货产品付款审核后即可发货,大部分期货产品在3周左右即可到货,提供时必达服务的产品订单审核十天内即可发货。

如订单处于未确定状态，进入“我的订单"页面，找到要取消的订单，点击“取消订单”按钮。

本网站所售商品都是正规清关，均开具13%正规发票，发票金额含配送费金额，另有说明的除外。

蚂蚁淘任何页面都有在线咨询功能，点击“联系客服”、“咨询”或“在线咨询”按钮，均可咨询蚂蚁淘在线客服人员， 或拨打4000-520-616，除此之外客户可在 联系我们页面找到更多的联系方式。

同个订单购买多个商品可能会分为一个以上包裹发出，可能不会同时送达，建议查看订单详情是否是部分发货状态；如未收到，可联系在线客服或者致电4000-520-616。

一般情况下，退货处理周期为客户收到产品一个月内（以快递公司显示签收时间为准），包装规格、数量、品种不符，外观毁损、短缺或缺陷，请在收到货24小时内申请退换货；特殊商品以合同条款为准。

步骤：1RNA抽提（同RT）
2逆转录使用合oligo
3p内参
4使用根据已知序列设计游引物提供游引物做PCR注意设计游引物退火温度与游引物相差
5产物切胶收TA克隆测序

oligo游引物我根据TakaraBD公司manual自设计经我使用效具体操作参照takara3－racemanual先做3－race解熟悉功再做5－race5－race要买试剂盒做较复杂

请以下列格式列出
机构：
负责人：
研究方向：如血液病，生育遗传咨询等
成绩：

非常感谢！

基克隆需要烟草内验证功能
　　基克隆利用体外重组技术,特定基其DNA顺序插入载体基克隆主要目标识别、离特异基并获基完整 全序列,确定染色体定位,阐明基化功能,明确其特定性状遗传控制关系通几十努力由于植物发育,理化,遗传等科迅速发展,使 掌握量关植物优良性状基物遗传知识,再运用先进酶物技术已经克隆与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质 及与植物发育关许基我实验室麻抗真菌蛋白基作功能克隆研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),克隆植物基探讨 其克隆,本文论述基克隆策略、及取些进展
　　1　功能克隆(functional Cloning)
　　功能克 隆根据性状基本化特性功能信息,鉴定已知基功能克隆(Collis,1995)其具体作:纯化相应编码蛋白构建 cDNA文库或基组文库,DNA文库基筛选根据情况主要用二种办进行,(1)纯化蛋白质进行氨基酸测序,据合寡核苷酸探针cDNA 库或基组文库筛选编码基,(2)相应编码蛋白制相应抗体探针,cDNA入载体表达库筛选相应克隆功能克隆种经典基克隆策略, 基离利用种策略
　　Hain等葡萄克隆两编码白藜芦醇合二苯乙烯合酶基(Vst1Vst2),葡萄抗菌化合 物白藜芦醇存,提高灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)抗性,烟草其些植物二苯乙烯合酶,克隆该基经转基,些植物产灰质葡萄孢抗性意义(Hain 等,1985)Kondo等1989编码水稻巯基蛋白酶抑制剂基组DNA做克隆序列析(Kondo等,1989)周兆斓等构建水稻 cDNA文库,离编码水稻巯基蛋白酶抑制剂cDNA(周兆斓等,1996)植物蛋白酶抑制剂类抗虫物质,抑制摄食害虫蛋白质消 化,使害虫缺乏所需氨基酸导致非发育或死亡胡华等烟草离流行于我黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆编码该病毒外壳蛋白cDNA基(胡华等,1989)王春香等病烟草叶片离纯化马铃薯x病毒 (potato virus X, pvx),克隆完整马铃薯x病毒外壳蛋白基,并外壳蛋白基转入马铃薯,期获抗pvx病毒栽培种马铃薯(王春香等,1991)病毒外壳 蛋白(Coat protein cp)基功克隆,使转基植物产病毒外壳蛋白基介导抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介导抗性Van kan 报道真菌功克隆毒基Avr9,直接利用基介导广谱高效基工程植物(Van Kan等,1991)我1995构建麻cDNA文库,制备抗体探针功离编码麻抗真菌蛋白基cDNA克隆,抗真菌基农业、医 药等面应用打基础(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997)功能克隆特点用基表达产物蛋白质克隆基、虽某性状编码基未 知其理化及代谢途径研究比较清楚,离纯化控制该性状蛋白质功能克隆关键离纯度高蛋白质要纯 蛋白质,十特异探针,策略行效采用功能克隆虽已经克隆基,由于绝数基产物目前知道所数基 难用经典克隆随着物技术发展,条新基克隆策略逐渐形,定位克隆
　　2　定位克隆(Positional cloning)
　　根据遗传连锁析,染色体步移基定位染色体具体位置断缩筛选区域进克隆该基,研究该基功能或抗性化机制,种策略 叫定位克隆(Monaco,1994)连锁析即通基与DNA标记间重组系数估计两者间距离,若某种性状基与DNA标记代 离,即连锁起趋势根据原理与已知某DNA标记连锁基染色体定位由于连锁析需要依赖特定基作连锁标记,即标记基 与待研基间存连锁关系,满足与待研基相连锁基实太少,所连锁析克隆数基存着定困难RFLP现使态性基标记存 于整基组内,解决连锁析难克服困难
　　1980Wyman等科家首建立限制酶切片段度态性RFLP (restriction fragment length polymorphism),使任何种表型相关基定位能限制酶切片段度态性用限制性内切酶切割产DNA片段度态性呈 孟德尔式遗传,存于全基组独特态标记,RFLP使基定位变易行(Wyman等,1980)目前定位克隆般用RFLP等标记制作 遗传图谱,寻找与待测基连锁RFLP标记,获基染色体定位克隆基所RFLP发展起RAPD技术建立,待测基相 准确定位,利用已知基离与连锁未知基其基本程序构建基组文库、用已知A基探针,基组文库筛选与其同源序列 a克隆,再用a克隆探针基组文库筛选与a克隆同源序列b克隆,类推筛选未知基并离目前已番茄、烟草、麦、 水稻、豆、玉米等植物发现与抗病基紧密连锁RFLP标记并构建遗传图谱(Figdore等,1988;Heun等,1991;Smith, 1991;Diers等,1992)用种已别克隆拟南芥菜、番茄、水稻等植物关抗病基(Martin等,1993;Bent等, 1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995) Martin等1993早用定位克隆技术克隆番茄pto基,pto基负责带毒基Avrpto细菌,丁香假单胞菌 (pseudomonas syringae pv)菌株抗性,Pto基导入病番茄转基植株增强病原菌抗性(Martin等,1993)Wenyuan等1995用技术克隆 水稻Xa21基,Xa21基真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具抗性(Wenyuan等,1995)
　　3　转座标记(transposon tagging)
　　转座 基位置转移另位置DNA片段转座程原位置DNA片段(转座)并未消失,发转移转座拷贝、基发转座引起插入突 变使插入位置基失并诱导产突变型或插入位置现新编码基通转座标记基(抗药性等)检测突变基位置克隆突变基 转座标记转座作基定位标记通转座染色体插入嵌合克隆基(Fedoroff等,1984;Jones等, 1994)
　　利用转座克隆植物基操作步骤主要应几面:(1) 已离转座与选择标记构建含转座质粒载体(2) 转座导入目标植物(3) 利用Southern杂交等技术检测转座否载体质粒转座目标植物基组,转座定位离目标基所缺少(4) 转座插入突变鉴定及其离(Ellis等,1992)通用于克隆植物基转座玉米Ac. Mu, SmpDs等Ac含编码转座酶基,能够自主转座,Ds含转座酶所能自主转座,Ds-Ac系统AcDs提供转座酶自主 转座用转座标记进行植物基离,首要Ac等转座转化要进行基克隆植物,目前数利用土壤农杆菌介导转化系统转座导入 目标植物(Keller等,1993;Bancroft等,1993)目前已玉米、烟草、番茄、亚麻等植物克隆抗性基(Johal Briggs,1992;Whitham等,1994;Jones等,1994;Gregory等,1995)JohalBrigge离抗灰色 蠕孢(Helminth osporium carbonum)1号种玉米HMI特异真菌抗性基该基存于玉米抗性品种,能够解蠕孢1号种产玉米具特异致病性HC毒素, 该基编码HC毒素脱毒酶使植物具抗病性(JohalBriggs,1992)转座标记原理相似T-DNA标记,两者都由于 段基插入导致染色体结构发变化产突变体,T-DNA标记产突变由于T-DNA插入导致Kenneth等利用T-DNA插入标记培育 拟南芥矮化突变体(Kenneth等,1989)
　　4　工合并克隆基
　　蜘蛛毒素种肽,37氨基酸,体外实 验表明能杀死种农作物害昆虫,蒋红等1995根据蜘蛛毒素氨基酸序列,采用植物偏密码、工合并克隆肽基(蒋红等, 1995)Adang 1995工合苏云金杆菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein)基(Adang等,1995)
　　5　表型克隆(phenotype cloning)
　　1995JonssonWeissman提表型克隆概念(JonssonWeissman,1995),些植物目前即解基产物,没 进行基定位,已知植物表型存差异,利用表型差异或组织器官特异表达产差异克隆植物基表型克隆San等用表型差异拟南芥 克隆赤霉素合酶基(Sun等,1992)表型克隆策略试图表型与基结构或基表达特征联系起,离特定表型相关基,力求必 事先知道基化功能或图谱定位根据基表达效应直接离该基(Brown,1994)
　　6　mRNA差异显示(mRNA differential display)
　　1993LiangAverboukh 等科家提mRNA差异显示(mRNA DD, mRNA differential display)案(Liang等,1993)案依据高等真核物所命程病理变化,论由单基控制由基控制 ,终都通基表达质或量差异体现研究基表达差异,研究两基组差异表达基离,克隆复杂性状相关基辟重要途径该 案检测、离全任何部突变mRNA,其基本程序:(1)提取两种细胞mRNA,反转录2种cDNA(2) 定引物作随机聚合酶链反应(3) 通扩增产物电泳析,离同品间差异条带(4)差异DNA做探针(5) cDNA文库或基组文库筛选基并作功能析(Baeur等,1993)LiangPardee建立mRNA差别显示PCR (LiangPardee,1992),该同析几品间基表达,检测灵敏度高,PCR扩增,些表达量低mRNA能检测 ,应用PCR及DNA测序两种技术简单易行,目前已功用离麦热激蛋白基(Joshi等,1996)水稻蔗糖调节基(Tseng等, 1995)等
　　7　减杂交(Subtractive hybridization)
　　Lee等1991提减杂交技术 (Lee等,1991),植物发育程同组织或同组织同发育阶段,由于基特异性表达,其mRNA表现同,表达特异基组织 提取 mRNA,反转录cDNA,特异基表达组织提取mRNA,两者杂交,表达特异基组织特异基表达组织均表达基产物形杂交 ,特异mRNA转录cDNA仍保持单链状态,种单链cDNA离即差异表达基,Chong等用技术克隆麦春化相关基 (Chong等,1994)
　　8　PCR扩增克隆
　　种参考已知基序列克隆基目前已经知道植物基序 列,克隆类似基先Gene bank库找关基序列,用PCR克隆同植物基基本根据已知基序列设计并合引物,植物提取DNA进行PCR扩增, 扩增片段纯化连接合适载体,用酶切析序列析检测重组,并与已知基序列进行比较,目前已玉米、水稻、向葵、巴西豆等植物离 富含甲硫氨酸蛋白及其编码基,根据Masumura等(1989)发表10KD水稻醇溶蛋白基序列合引物,王广立等克隆水稻10KD醇溶 蛋白基(王广立等,1994)
　　9　依据序列同源性克隆基
　　物种、属间编码基序列同源性高于非编码区序列 基本作其种属同源基克隆前提,构建cDNA文库或基组文库,已知基序列探针筛选目克隆马德钦等根据文献报道 甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基序列作菠菜甜菜碱醛脱氢酶基克隆序列析(马德钦等,1996)
　　综所述,见发现克隆基 程艰巨富收获,几十各科家基克隆激物高技术领域内走艰难曲折历程,创造发展述种种植物基 克隆,使类认识自、掌握自道路前进步前辈所创造技术疑我功克隆植物基提供快捷高效途径利用已知 序列克隆基,用同种或同属已知同源序列筛选基都比较容易,适合于克隆些研究较晚许重要农作物基获极纯蛋白质功能克隆关键,随 着蛋白质纯化技术提高,功能克隆发挥潜作用随着植物遗传图谱基定位基础研究工作提高,定位克隆发挥其巨作用

本实乃菜鸟若问题问清楚请指点

许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。 以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。 siRNA表达框架（siRNA expression cassettes，SECs）是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol Ⅲ启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol Ⅲ终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）向左转|向右转

真核表达载体克隆基因的时候把内含子也克隆进去了，在转到细胞里面表达时，这段内含子会被正确剪切掉吗？

最近有一些战友对荧光原位杂交技术比较感兴趣，我整理了相关资料和自己的心得，和大家交流一下。不妥之处，请大家指出，共同讨论学习。

内容发布在蚂蚁淘和螺旋网上，有兴趣的战友也可以去那里看一下。

内容分三部分：

一、概述

1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征

2、染色体异常常见的类型

3、染色体异常的检测方法

二、荧光原位杂交及其探针

1、荧光原位杂交的原理

2、荧光原位杂交的探针

三、荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交（按试验流程介绍）

:D

FISH.pdf(1237.91k)

tair网站

何鉴定克隆新基调亡相关基

病毒通常由具有蛋白质外壳的遗传物质组成，它通过穿透细胞膜并向细胞释放大量的病毒遗传物质而感染细胞。利用宿主细胞上特定的膜上病毒输送蛋白，进入感染的宿主细胞，向细胞释放大量的病毒遗传物质而感染细胞。由于细胞为无性体，因此它们依赖复制蛋白质或宿主细胞的“机体”来复制自己的DNA物质。从而篡夺细胞功能为其服务。其结果或使细胞死亡。病毒控制细胞。或着产生变异。正常细胞的蛋白质合成，细胞分裂是受结构基因、基因的调节系统所控制的。由于控制细胞增殖的结构基因发生突变，调节系统对它失去控制，结果就会造成细胞无限的增殖。如果是有关的调节基因发生了突变，它不再能产生有效的阻遏物质，控制增殖的结构基因的转录和翻译就会不断地进行，结果也将导致细胞的无限增殖。细胞发生变异。从而导致细胞癌变。

我现在要用bac克隆自己标记成探针做人类染色体水平的fish，以确定染色体的具体断裂位置。
现在已经把bac克隆的质粒DNA提取出来了，但是在标记探针前，有以下几个疑问：
1：提取出的质粒DNA是否需要通过测序等方法进行验证该克隆的准确性？
2：是否需要把bac克隆的DNA从载体上酶切下来？如果酶切，UCSC数据库中提供的两侧序列末端的酶切位点就是吗？如果不用酶切，那载体片断在探针标记时会不会一同标记上从而影响后续试验结果？
3：在探针标记前，酶切或不酶切得到的bac克隆DNA是否需要进一步纯化？用普通的琼脂糖电泳切胶回收纯化就可以吗？那所用的切胶回收试剂盒应该是哪种的呀？
4：像我这种自己标记好探针，在作fish时，有现成的试剂盒吗？
第一次做fish，有好多不是很清楚的地方，查阅大量文献中也只是提供其中几个关键步骤，希望有经验的朋友提供宝贵意见，给与指导。
非常感谢！！！

工复制基