限制性核苷酸酶与DNA连接酶分别作用于什么部位？
| 实验方法原理 | 许多真核生物的基因所包含的DNA，远非单个重组子所能容纳得了的。对于大多数染色体来说，更是如此。因此，必须构建一套重叠的DNA克隆，这些克隆的DNA按次序排列能形成叠连序列（叠连群），可以涵盖一个很大的基因或目的区域。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | T4噬菌体DNA连接酶限制性内切核酸酶PstⅠ或NsiⅠ耐热性DNA聚合酶模板DNA 试剂、试剂盒 | 扩增缓冲液dNTP溶液乙醇酚氯仿醋酸钠T4DNA连接缓冲液 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶核酸和寡核苷酸寡核苷酸盒带过滤层吸头薄壁微量离心管移液器程控式PCR仪水浴或冷却装置
实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 10X扩增缓冲液 dNTP溶液（1mmol/L，包括所有4种dNTP(pH8.0；PCR级) 乙醇 酚：氯仿（1:1,V/V） 醋酸钠（3mol/L,pH5.2） 10XT4DNA连接缓冲液 2.酶及其缓冲液 T4噬菌体DNA连接酶 限制性内切核酸酶PstⅠ或NsiⅠ 耐热性DNA聚合酶 3.凝胶 琼脂糖凝胶 核酸和寡核苷酸 寡核苷酸盒[5.0OD260/ml(~8.5μmol/L)]，用TE(pH7.6)溶解5"CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAGGGTTAGGTTCCTGCTACATCTCCAGCCTTGCA3" 寡核苷酸（接头）引物[5.0OD260/ml(~17μmol/L)],用TE(pH7.6)溶解。5"CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAG3" 序列特异性寡核苷酸（载体)引物[5.0OD260/ml(~17μmol/L)]。用TE(pH7.6)溶解。 模板DNA:重组BAC、YAC或黏粒DNA 4.专用设备 自动移液器用的带过滤层吸头 扩增用的薄壁微量离心管（0.5ml) 阳性对照专用的移液器 储存有扩增程序的程控式PCR仪 15℃水浴或冷却装置 二、方法 1.用PstⅠ或NsiⅠ消化约5μg模板DNA。取一小份反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳，以确证所有的DNA都已经被酶解。 2.用酚:氯仿抽提混合液及标准的乙醇沉淀法回收DNA，然后用70%的乙醇洗涤沉淀。将管子开口倒扣在一叠卫生纸巾上，使最后残留的乙醇挥发，然后用50μlH2O溶解湿润的DNA沉淀。 3.在一个无菌的0.5ml的微量离心管中，依次加入下列物质：10XT4DNA连接酶缓冲液10μl，消化后的DNA模板20μl，寡核苷酸盒子5.0OD260/ml2μl，T4噬菌体DNA连接酶5Weiss单位/μl2μl，加水至100μl。 设3个对照管，对照管的体系参照上述配方。其中一个无模板DNA，另一个无寡核苷酸接头，第3个无T4DNA连接酶。 4.将实验管及对照管在15℃下连接12~16h。 5.在一个无菌的0.5ml的微量离心管中，依次加入下列物质：10X扩增缓冲液2μl，1mmol/L4种dNTP混合溶液（pH7.0）2μl，接头的寡核苷酸引物5.0OD260/ml1μl，载体的寡核苷酸引物5.0OD260/ml1μl，取自步骤4的实验管DNA连接产物1μl，耐热DNA聚合酶5.0单位/μl0.5μl，加水至20μl。 设3个PCR对照。每只对照管中含有连接反应中相对应的对照反应液1μl。 6.如果PCR仪没有高温顶壳，在反应混合体系里加一滴（约50μl）轻矿物油，以防止加热和冷却循环时样品的蒸发。另外，如果用热启动则加一滴石蜡。 7.将PCR管放入PCR仪中，按下表输入程序后，开始扩增。  8.将每一管扩增产物都取出一份（25%)，用琼脂糖凝胶电泳分析。  免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
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发布于 ： 2021-09-05
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