调节瞬时转染基因的表达

l四环素作为哺乳动物细胞中可诱导基因表达的调控物

阶段一：pTet-tTAk稳定转染成纤维细胞

培养和转染细胞

1.在DMEM完全培养液中培养贴壁细胞。转染前一天，把细胞换到含有0.5μg/ml四环素-HCl（四环素）的DMEM完全培养液中。每个10cm培养皿中加入足量细胞，使转染那天，细胞可以有33%的汇合度。

2.在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每秒质粒的浓度调整为≥0.5mg/ml。10～20μg质粒pTet-tTAk和1～2μgpSV2-His（Tet质粒与带选择标记的质粒的摩尔比大约为10：1）与500μlHEPES缓冲液在一个干净的4ml聚丙乙烯管中混合。

3.DNA混合物中加入32.5μl2mol/LCaCl₂。立即轻轻振荡使溶液混匀。溶液在室温保存，不时地混匀。15～30min后会形成絮状沉淀。

4.吸掉步骤1准备的细胞培养皿中的所有培养液。

5.用巴斯德吸管混合CaCl₂-DNA若干次。滴加混合物，使它均匀地盖在单层细胞上。

6.细胞在37℃，5%CO₂条件下培养30min，15min后摇动培养皿，保证DNA沉淀物的均匀覆盖。

7.每个细胞培养皿中加入10ml含有四环素的DMEM完全培养液。细胞在37℃，5%CO₂条件下培养4～5h。

8.轻轻吸掉培养液。避免破坏细胞上的沉淀物。

9.加2.5ml含15%甘油而且预热到37℃的HEPSE缓冲液进行甘油休克。细胞在室温放置2.5min。甘油是滴加到培养液中。

10.恰好在2.5min的时候吸掉甘油溶液。操作得快一点，因为甘油对细胞毒性很大。

11.立即又轻又快地加入10ml含有四环素地DMEM完全培养液洗细胞。立即吸掉培养液，再重复洗涤。

12.细胞中加入10ml含有四环素地DMEM完全培养液，37℃培养过夜。

13.转染后大约16～24h，吸掉培养液，换上10ml含有四环素的DMEM完全培养液。转染后一共在37℃培养48h（即步骤12和13的总培养时间）。

转染细胞的筛选和克隆

14.转染后48h，细胞用几种稀释度分到含有125μmol/LL-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl的培养液中。细胞密度为每个10cm培养皿大约1×10⁶到3×10⁴。含有大约1×10⁵细胞的培养皿需要培养若干个。

15.细胞在选择培养液中培养4天后，接着用3～4ml含有125μmol/LL-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl的选择培养液培养。

16.集落形成后（通常经过大约10～12天选择培养），换成含有250μmol/LL-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl的选择培养液。

17.集落长好以后（选择培养12～15天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。

18.用大约100μl磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加2滴1×胰酶-EDTA（100μl）并放置30～60s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到24孔组织培养液板的一个孔中，每个孔中有1ml含250μmol/LL-组氨醇和四环素的选择培养液。

19.当孔中的细胞长到80%汇合度，把它们转移到6cm组织培养皿中，用含有500μmol/LL-组氨醇和四环素的选择培养液。

20.细胞在含有500μmol/LL-组氨醇和四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行1：5到1：10稀释）。

细胞进行蛋白诱导表达测试

21.当单层细胞再次生长到大约80%汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试蛋白的诱导表达。

22.如果细胞用tTA和靶质粒共转染，可以如阶段3所述直接分析靶基因的产物。如果细胞只用pTet-tTAk质粒转染，如下进行细胞的诱导表达测试：

a.诱导前一天，细胞以适当的密度在含有500μmol/LL-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl的DMEM培养液培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。

b.第二天，用PBS细胞洗细胞3次，每次都要轻轻旋转培养板。

c.第三次洗涤后，立即加入含有500μmol/LL-组氨醇但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养6～48h。

23.通过Northern分析或免疫印迹法测试细胞中tTA的诱导表达。然后如阶段2所述，用靶质粒转表达tTA的细胞系。

阶段2：四环素调控的靶基因稳定转染可诱导表达tTA的NIH-3T3细胞

培养和转染细胞

1.在含有500μmol/LL-组氨醇和0.5μg/ml四环素-HCl完全选择培养液中培养可以诱导表达自身调控的tTA的稳定细胞系（阶段1中的分离得到）。转染前一天，把细胞传代到含有完全选择培养液的10cm组织培养皿中。每个培养皿转入足量细胞，使转染那天单层细胞可以有33%的汇合度。

2.在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每种质粒的浓度调整为≥0.5mg/ml。每种靶基因质粒10～20μg和1～2μgpPGKPuro（每种四环素质粒与带选择标记的质粒摩尔比位10：1）与500μlHEPES缓冲液在一个干净的4ml聚丙乙烯管中混合。

3.进行阶段1中步骤3-13。

选择和克隆转染细胞

4.转染后48h，细胞用几种稀释度分到含有500μmol/LL-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液中。细胞密度为每个10cm培养皿大约1×10⁶到3×10⁴。含有大约1×10⁵细胞的培养皿需要培养若干个。

5.细胞在选择培养液中培养4天后，接着用3~4ml含有500μmol/LL-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液培养。

6.集落长好以后（选择培养12～14天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿中挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。

7.用大约100μl磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加2滴1×胰酶-EDTA（~100μl）并放置30～60s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到24孔组织培养板的一个孔中，每个孔中有1ml含有500μmol/LL-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液。

8.当孔中的细胞长到80%汇合度，把它们转移到6cm组织培养皿中，用含有500μmol/LL-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液培养。

9.细胞在含有500μmol/LL-组氨醇、3μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行1：5到1：10稀释）。

10.当单层细胞再次生长到大约80%汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试靶基因蛋白的诱导表达。测试方法在阶段3介绍。