
Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA) is a water-in-oil emulsion that is similar to the Complete Freund’s Adjuvant (CFA) without addition of heat-killed mycobacteria (Mycobacterum butyricum).
IFAVax consists of a mixture of mineral oil and emulsifier in a ratio of 85% v/v oil and 15% v/v emulsifier. Importantly, the IFAVax is not a pre-formed emulsion and thus it must be mixed with an equal volume of aqueous solution of antigen and subsequently emulsified prior to use. The emulsifier is mannide monooleate, an ester consisting of mannitol as the hydrophilic residue and oleic acid (unsaturated C18 fatty acid) as the hydrophobic part.
VaxOZ adjuvants from OZ Biosciences are intented for research use only.
Sizes:
10 mL
5x10 mL
10x10 mL
Also available in bulk, please contact us: order@ozbiosciences.com
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2逆转录使用合oligo
3p内参
4使用根据已知序列设计游引物提供游引物做PCR注意设计游引物退火温度与游引物相差
5产物切胶收TA克隆测序
oligo游引物我根据TakaraBD公司manual自设计经我使用效具体操作参照takara3-racemanual先做3-race解熟悉功再做5-race5-race要买试剂盒做较复杂
cDNA文库含有一种生物的部分基因,cDNA本质就是外显子
基因组文库大,其中基因含有启动子和内含子
cDNA文库小,没有内含子和启动子
我总共要做6个克隆。先把6个基因的CDNA克隆到shuttle质粒pAdTrack-CMV,进展很顺利。然后用PmeI处理重组shuttle质粒,过夜酶切,也很顺利。但与腺病毒backbone质粒pAdEasy-1共转化时遇到了大麻烦。起初,我没有BJ5183Ecoli菌株,就想当然像拿DH5a替代,但一直不成功。无论CaCl2法和电转法都不行,挑出来的克隆不是只含重组shuttle质粒,就是同时含有两种质粒,即重组shuttle质粒和pAdEasy-1。但各是各的,二者并没有在细菌内发生同源重组。
于是我借了BJ5183Ecoli菌株,采用电转化法,这时总算有点成功。6个重组腺病毒质粒构建成功了4个。经酶切鉴定均这4个克隆均正确。但是,另外2个总是失败,原因不详。于是我就重复重复,期间,糟糕的事情发生了....电转杯总是被击破,Bio-Rad电转仪总是出现"检测到低压故障电弧”的字样。想来想去找不到好的对策。起初我以为是有气泡,于是在做电转时尽可能避免气泡的出现。遗憾的是,这毫无帮助,电转杯还是击一个破一个。我那个心疼呀。倒不是心疼杯子,心疼的是我的细菌、质粒,用Tip又吸不出来,所以只好把它们丢掉。
Finally,我发现了其中的问题。我改用去离子水来溶解重组shuttle质粒和pAdEasy-1时电转杯就再也不破了。我分析,原因可能与电转菌液的离子强度有关。当我放较大体积(>15ul)的质粒到BJ5183Ecoli菌(20ul)中时,里面的TE缓冲液可能导致电击时产生高强度电流,结果杯子就破了。由此看来,气泡本身对电击可能不无影响,反而会减弱电流强度。但离子强度就不同了,离子强度太高,足以导致一次实验报废。
后感:失败并不可怕,可怕的是想当然去重复,而不去探究失败的原因。朋友们,如在这方面好的经历坏的经历,尽可拿出来一起分享。
让我们一起成长。
用引物PCR扩增目基片段;
选择合适(抗性标记、酶切位点等)克隆载体(保真扩增),并PCR片段连接入克隆载体;(般用Taq酶PCR产物末尾自带A,Solution 1作用与两端各带T线性T载体直接相连)
连接产物转化入受态肠杆菌,使含抗素培养基扩增;
肠杆菌提取质粒(即前面连接产物),酶切鉴定测序鉴定均误目基片段切并与新表达载体连接,再转化入肠杆菌扩增,再提质粒,即想要目基片段克隆.
是不是只要从细胞里面提取基因组DNA,然后按照pubmed上的5端上游序列做一个PCR就可以了?
很多,其反应本质是先切断DNA的磷酸二脂键,改变DNA的链环数之后再连接之,兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能.然而它们并不能连接事先已经存在的断裂DNA,也就是说,其断裂反应与连接反应是相互耦联的。拓扑异构酶(包括Ⅰ型和II型)都可以用符号转化模型进行解释(下图左中)
除了DNA拓扑异构酶可以产生异构变化以外,很多能够嵌入相邻碱基之间影响碱基堆集作用的试剂,特别是片状的染料分子.也能改变DNA的拓扑状态,最明显的例子就是溴化乙锭(ethidium bromide)。例如以SV40的CCC分子与溴化乙锭的结合试验为例,当没有染料时,此DNA为负超螺旋,具有较高的沉降常数(21S);当加入染料分子与核苷酸之比为0.05时,沉降数降至l6S,此时DNA为没有超螺旋的松弛形式;当染料分子和核苷酸的比值增加到0.09时,沉降常数又上升到大约21S,此时DNA分子为正超螺旋。这种关系如上图右所示,不过要注意的是,溴化乙锭并没有改变Lk值,只不过是由溴化乙锭分子的嵌入,增加了局部DNA二级结构的紧缠状态。因而,随着嵌入染料分子数的增多,起初表现为负超螺旋的减少与消失,随后便是正超螺旋的增加。这与单链DNA结合蛋白促进负超螺旋转变为泡状结构的情况是类似的。
拓扑异构酶(topoisomerase):通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键,然后重新缠绕和封口来改变DNA连环数的酶。DNA促旋酶。
DNA拓扑异构酶 DNA topoisomerase
为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的偶联反应,为了分析体外反应机制,用环状DNA为底物。在闭环状双链DNA的拓扑学转变中,要暂时的将DNA的一个链或两个链切断,根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为Ⅰ型拓扑异构酶(top- oisomeraseⅠ),通过切断二个链来进行的称为Ⅱ型拓扑异构酶(topoisomeraseⅡ)。属于Ⅰ型的拓扑异构酶,有大肠杆菌的ω蛋白(ω-protein,由分子量11万的单个多肽链所成)及各种真核细胞中存在的切断-结合酶(nicking-closing enzyme,分子量约6万5千—7万的及分子量约10万的)。Ⅱ型拓扑异构酶,有存在于细菌中的DNA促旋酶、噬菌体T4的拓扑异构酶Ⅱ以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶Ⅱ等。另外,噬菌体λ的irt基因产物和噬菌体φX174的基因A的产物等也具有切断—结合酶的活性,可认为是拓扑异构酶之一种。Ⅰ型拓扑异构酶不需要ATP的能量而催化异构体化,作为反应的中间产物,在原核生物来说是游离型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端与酶形成共价键,而真核生物是3′-OH末端5′-磷酸末端与酶形成共价键。此酯键中所贮存的能量,可能在切断端的再结合上起着作用。Ⅰ型拓扑异构化酶催化的反应有下列各种:使超螺旋DNA在每一切断—结合反应中,使L数(参见DNA拓扑学异构体)发生一种变化,即松弛(relaxation)(图1)。将互补的单链环状DNA转变成具有螺旋结构的双链环状DNA(图 2),使单链DNA打结(topological knot)或解结(图3)。另外在二个环状双链DNA一个分子的一个链切断时,形成链环状二聚体的分子(ca-tenane)。在Ⅱ型拓扑异构酶中,DNA促旋酶可单独催化闭环状DNA产生超螺旋,这是独特的。其它二个型的酶,除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外,还可催化促旋酶的催化反应。真核细胞的拓扑异构酶Ⅰ,参与核小体的形成,细菌的ω蛋白参与转录和某种转位子的插入。促旋酶和T4拓扑异构酶Ⅱ参与DNA的复制和转录过程。 DNA 拓扑异构酶 I (DNA Topoisomerase I)催化4种反应:①超螺旋的松弛;②绳结(knot)的形成;③环状双链分子的形成;④环状双链分子的连接。本酶由于来源于小牛胸腺,与来源于原核生物的酶性质不同,即使在Mg2+不存在的条件下也显示活性。而且,原核生物由来的DNA Topoisomerase I 只作用负链的超螺旋分子,而本酶则能使正负两方的超螺旋分子均形成松散型。向左转|向右转
用引物PCR扩增目基片段;
选择合适(抗性标记、酶切位点等)克隆载体(保真扩增),并PCR片段连接入克隆载体;(般用Taq酶PCR产物末尾自带A,Solution 1作用与两端各带T线性T载体直接相连)
连接产物转化入受态肠杆菌,使含抗素培养基扩增;
肠杆菌提取质粒(即前面连接产物),酶切鉴定测序鉴定均误目基片段切并与新表达载体连接,再转化入肠杆菌扩增,再提质粒,即想要目基片段克隆.
我现在做的课题研究的是肾脏肿瘤。其中有实验涉及到FISH。咨询和查阅过相关文献和公司,一个染色体荧光探针的价格贵的惊人(动不动近万),做过这方面实验的老师,情况是这样的吗?
我要做的是在石蜡切片上进行FISH实验,操作难度是不是很大?有没有公司可以帮助完成此类实验呢?
请知道的老师给我帮助,谢谢!!

