| 实验材料 | 样本DNA 试剂、试剂盒 | NaOH对苯二酚重亚硫酸钠矿物油DNAWizardcleanupkit(Promega)或等同物异丙醇糖苷配糖基乙酸胺乙醇10XPCR扩增缓冲液4dNTP混合物TaqDNA聚合酶 仪器、耗材 | 水浴设备Vacuummanifold带控制管温度显示和适合管的热循环仪 实验步骤 | 1.把样品DNA(达1ug)稀释到1.5ml微离心管中的50ul水中。如果使用的DNA更少（包括从石蜡包被的样品提取的DAN)，预期的产量少（如很微弱的条带）或者增加循环次数提高产量。准备好阳性和阴性对照DNA的稀释液和样品平行进行以下步骤。 2.加入5.5ul2mol/LNaOH。37°C，孵育lOmin。加入3u1新鲜配置的l0mmol/L对苯二酚和520ul新鲜配置的3mol/L重亚硫酸钠。混勻并加入足量的矿物油（约50ul)用以覆盖水相。50°C孵育16h。 3.除去油。加入1mlDNAWizard试剂，把混合物加到试剂盒带有的niiniprep柱。真空处理。用2ml80%异丙醇洗。把柱子置于一个干净的1.5ml管，加入50ul60~70°C的水。离心管子和柱子1min。每管加入55ul3mol/LNaoH，室温孵育5min。 4.加入1ul10mg/ml糖苷配糖基，然后加入17ul10mol/L乙酸胺和3体积100%的冰冻乙醇。-20°C，沉淀DNA几小时或过夜，离心20mm，去上清，用冰冻的70%的乙醇清洗，加入20~30ul水溶解。处理单链DNA要像处理RNA—样（冷冻，尽量减小反复冻融，可能的话保存在-70℃。 5.进行甲基化和非甲基化反映所要分析的样品的数目，包括阳性和非DNA对照。准备好甲基化和非甲基化PCR反应（50ul)的主要反应混合物，包括： 5ul10XPCR扩增缓冲液； 2.5ul25mmol/L4dNTP混合物； 1ul300ng/ul的有义引物； 1ul300ng/ul的反义引物； 28.5ul水。 混匀。 6.取3.8ul主要反应混合物到标记的PCR管。每管加人2ul重亚硫酸钠修改的DNA模板（第4步）。如果需要，每管加入25~50ul的矿物油，放入热循环仪。PCR从95°C变性5min开始。 7.对每个样品，取1.25UTaqDNA聚合酶稀释到10ul无菌蒸馏水中。通过油层加入到40ul混合物中，并轻轻地吹打。也可以选择用其他形式热启动PCR。按如下所示继续PCR扩增。 35个循环： 30s95℃(变性) 30s不同的引物温度不一样(退火) 30s72℃(延伸) 最终步骤： 4°C保存反应产物直至分析。 8.准备6%~8%(m/V)非变性聚丙烯酰胺胶，用1XTBE缓冲液作溶剂（单元7.2)。10V/cm跑垂直胶1?2h，每个样品的反应产物在相邻的泳道，这样可以对甲基化和非甲基化位点之间进行直接的比较。包括阳性和阴性对照。 9.用溴化乙键染胶，在UVtransIlluminator观察并对胶进行拍照（附录3G)。一般情况下，产物的范围是80~200bp。 |
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