●Anti-pADPr,clone10H,mousemonoclonalantibodyThismousemonoclonalantibody,clone10H,recognizespoly(ADP-ribose).ItwasdevelopedandoriginallydescribedbyH.Kawamitsu etal. (1984) Biochemistry23,3771.Poly(ADP-ribose)isapolymersynthesizedbyaclassofenzymesnamedpoly(ADP-ribose)polymerase(PARP).UsingNAD+assubstrate,PARPcatalyzestheformationofthepolymerpADPr,withchainlengthsrangingfrom2to300residues,containingapproximately2%branchinginthechain.pADPrbecomesattachedtonuclearproteins,andtoPARPitself(automodification).Usesfortheclone10Hmonoclonalantibodyhasbeendescribedextensivelyintheliterature,andincludeWesternblotting,immunostaining(seebelow),ELISA-basedPARPactivityscreen,andimmunodotblot.
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TulipBiolabs生产用于Poly(ADP-核糖)和合成大麻素研究的蛋白质,抗体和试剂盒,可用于学术,制药,工业和政府实验室。Tulip还提供定制的ELISA分析开发生化分析,以及大分子的生物分析方法验证。专注于开发和执行针对生物分子和药物的专门化验。TulipBiolabs,Inc.成立于2000年,是一家私人研究和产品开发实验室。多年来,Tulip扩大了产品线,并完成了许多项目的合同工作。Tulip对开发用于药物发现的聚ADP-核糖基化研究试剂和测定法感兴趣。Tulip还对开发用于大分子药物组织分析和滥用药物的检测方法感兴趣。Tulip的实验室设施位于美国宾夕法尼亚州的兰斯代尔。
抗pADPr,克隆10H,小鼠单克隆抗体该小鼠单克隆抗体,克隆10H,识别聚(ADP-核糖)。它由H.Kawamitsu等人开发并最初描述。(1984)Biochemistry23,3771。聚(ADP-核糖)是由称为聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的一类酶合成的聚合物。使用NAD+作为底物,PARP可催化聚合物pADPr的形成,链长范围为2至300个残基,在链中包含约2%的支链。pADPr附着于核蛋白和PARP自身(自动修饰)。克隆10H单克隆抗体的用途已在文献中进行了广泛描述,包括Western印迹,免疫染色,基于ELISA的PARP活性筛选和免疫斑点印迹。
抗PARP1,全蛋白IgY鸡多克隆抗体TulipBiolabs,Inc.抗PARP1,目录号1051的IgY鸡多克隆抗体,是使用在杆状病毒表达系统中表达的高度纯化的重组全长人PARP1制备的。由WB,Cat。#1051识别完整的PARP1MW=113kDa,89kDa细胞凋亡诱导的裂解产物以及其他较低分子量的PARP1片段。
PARP14m3MARylated磁性亲和树脂TulipBiolabs,Inc.PARP14m3磁性树脂设计用于从细胞和组织裂解物中分离单ADP-核糖基化(MARylated)蛋白质。通过使用高度特异性的PARP14m3亲和树脂,可以从细胞或组织裂解物中分离出单ADP-核糖基化(MARylated)蛋白。使用与PARP14m3共价结合的磁珠的便利性进行纯化。可以从亲和树脂中干净地洗脱与树脂结合的蛋白质,然后通过质谱,免疫印迹和其他方法进行分析。PARP14m3磁性亲和树脂,产品目录。#2414是高度纯化的人PARP14巨域3融合蛋白构建体,在大肠杆菌中表达,并化学结合到1μm超顺磁珠上。
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用引物PCR扩增目基片段;
选择合适(抗性标记、酶切位点等)克隆载体(保真扩增),并PCR片段连接入克隆载体;(般用Taq酶PCR产物末尾自带A,Solution 1作用与两端各带T线性T载体直接相连)
连接产物转化入受态肠杆菌,使含抗素培养基扩增;
肠杆菌提取质粒(即前面连接产物),酶切鉴定测序鉴定均误目基片段切并与新表达载体连接,再转化入肠杆菌扩增,再提质粒,即想要目基片段克隆.
目基表达基工程叙述~
cDNA文库含有一种生物的部分基因,cDNA本质就是外显子
基因组文库大,其中基因含有启动子和内含子
cDNA文库小,没有内含子和启动子
我已经知道了这个基因在其他物种中的序列和它所编码的蛋白质的序列,导师的意思是让我把它在大豆中克隆出来。我该怎么办?
听导师说,可能要用到RT-PCR。谁能帮帮我?
感激不尽啊!
4.1
EST序列获取
利用计算机协助克隆第步必须获兴趣ESTdbEST数据库找EST途径寻找同源序列标准:度≥100bp同源性50%、85%通数万维网界使用BLAST检索程度实现其用NCBI(National Center for Biotechnology Information)GenBank、意利TigemESTmachine(包括EST提取者EST组装机器)、THC(Tentative Human Consensus Sequences)数据库、ESTBlast检索程序——通英类基组作图项目资源(Human Genome Mapping Project Resource CenterHGMP—RC)服务器访问检序列组装重叠群(contig)重叠群检序列重复进行BLAST检索与序列组装延伸重叠系列重复程直没更重叠EST检或者说重叠群序列能继续延伸获全基编码序列获些EST序列数据再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测假凤精确匹配基EST序列数据据EST六种阅读框翻译蛋白质接着与蛋白质序列数据库进行比较析基析结致三种:第已知基研究象类已鉴定解基;第二前未经鉴定新基;第三未知基部基间同种或异种基匹配新基未知基进步用于物研究
4.2
基电定位
基电定位采用NCBI电PCR程序进行检索寻找EST序列否存序列标签位点(sequence tagged sites,STS)STS作基组单拷贝序列新代遗传标记系统其数目覆盖密度较达平均每1kbSTS或更密集寻找STS与相应染色体相比较即序列定位该染色体
4.3
IMAGE克隆索取
许ESTs所应cDNA克隆通基组及其表达整合析(intergrated molecular analysis of genomes and their expressionIMAGE)协定免疫索取与电基克隆相辅相IMAGE协定由美LLNL家实验室主持宗旨共享排列cDNA文库克隆重规模EST测序项目Merk&Cow公司投资类ESTs项目等都加入IMAGE协定研究者通另外途径基部序列并通同源性检索发现该片段与加入IMAGE协定EST序列高度同源便免费索取其原始克隆通美ATCC组织(American Type Culture Collection)索取避免或减轻筛选全基麻烦集精力进行基功能研究图" class="ikqb_img_alink">
举例言目前家药典条宿主DNA残留检测
是不是只要从细胞里面提取基因组DNA,然后按照pubmed上的5端上游序列做一个PCR就可以了?
最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究。
不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素。 以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。
最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。
不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。
用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol Ⅲ启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol Ⅲ终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protocol可以解决这一问题)②不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)向左转|向右转
我现在做的课题研究的是肾脏肿瘤。其中有实验涉及到FISH。咨询和查阅过相关文献和公司,一个染色体荧光探针的价格贵的惊人(动不动近万),做过这方面实验的老师,情况是这样的吗?
我要做的是在石蜡切片上进行FISH实验,操作难度是不是很大?有没有公司可以帮助完成此类实验呢?
请知道的老师给我帮助,谢谢!!