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根据保守区克隆基因家族的新基因遇到的问题特来请教
2021-08-16
问题描述:

我的题目是鸡Mx基因的克隆,我的策略是先根据该基因家族(dynaminfamily)的氨基酸保守区设计简并引物克隆出该基因CDNA的部分片段,然后根据该片段序列设计基因特异性引物,利用RACE技术得到cDNA的3‘和5’末端,然后根据末端序列设计引物扩增出该基因全长cDNA.

我用简并引物从鸡cDNA中扩增出一个片段,约250bp,测序后拿来BLAST时却发现,与之同源性最高的并不是其它的Mx基因,而是人的某一个基因,比对的结果中与该序列同源性较高的有人及鼠Mx基因,但是同源性并不是很高。该基因在同一种生物的不同品种中具有多态性,已经有其它的鸡的Mx基因被克隆,按道理如果该片段是Mx基因的一部分它应该与其它的鸡的Mx基因有很高的同源性才对呀,所以,我怀疑简并引物PCR扩增出来的该片段不是Mx基因,因为RACE试剂盒很贵,现在也不敢继续作下去,怕作下去得不到什么结果。现在贴上我BLAST结果中score排在最前面的部分,还请有经验的兄弟帮我分析分析。我不胜感激。

Sequencesproducingsignificantalignments:(bits)Value

gi|19807872|gb|AC087694.3|Homosapienschromosome8,clone...460.033
gi|19073805|gb|AC090733.7|Homosapienschromosome8,clone...460.033
gi|38081550|ref|XM_358891.1|MusmusculussimilartoMyxovi...440.13
gi|47026513|gb|AC024957.9|Musmusculuschromosome16,clon...440.13
gi|13435314|gb|AC090999.1|CaenorhaBDitiseleganscosmidY8...440.13
gi|21955645|emb|AL732599.5|MouseDNAsequencefromcloneR...440.13
gi|199921|gb|J03368.1|MUSMX2Mouseinterferon-inducedMx2m...440.13
gi|31442540|gb|AC138314.4|MusmusculusBACcloneRP23-218B...420.52
gi|21591808|gb|AC092491.6|Homosapiens12BACRP11-125G9(...420.52
gi|40949625|gb|AC127597.5|MusmusculusBACcloneRP23-71A1...420.52
gi|6996929|ref|NM_010846.1|Musmusculusmyxovirus(influen...402.1
gi|15029783|gb|BC011113.1|Musmusculusmyxovirus(influenz...402.1
gi|13938021|gb|BC007127.1|Musmusculusmyxovirus(influenz...402.1
gi|19705454|ref|NM_134350.1|Rattusnorvegicusmyxovirus(i...402.1
gi|16041423|gb|AC091589.8|Homosapienschromosome18,clon...402.1
gi|47104230|gb|BT012815.1|Lycopersiconesculentumclone11...402.1
gi|20270172|gb|AC114485.2|Homosapienschromosome1clone...402.1
gi|28372591|gb|AC008939.8|Homosapienschromosome5clone...402.1
gi|19310326|gb|AC105250.3|HomosapiensBACcloneRP11-39C1...402.1
gi|37537322|dbj|BS000055.1|Pantroglodyteschromosome22c...402.1
gi|37537321|dbj|BS000054.1|Pantroglodyteschromosome22c...402.1
gi|18464281|gb|AC104690.2|HomosapiensBACcloneRP11-183P...402.1
gi|15321560|gb|AC079232.7|HomosapiensBACcloneRP11-360H...402.1
gi|56724|emb|X52713.1|RNMX3RatmRNAforMx3protein402.1
gi|56722|emb|X52712.1|RNMX2RatmRNAforMx2protein402.1
gi|56720|emb|X52711.1|RNMX1RatmRNAforMx1protein402.1

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westernblot
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象这种情况,你要多测序几个克隆。兼并引物做出来的结果确实有可能是假阳性。我觉得你可以做测几个,还有不要放弃现在的结果。因为你的序列和别的物种的Mx基因有高的同源性。这应该是对的。另外,你将序列做个蛋白预测,看氨基酸结果是否相近。如果出入很大,还是从新设计引物把。
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yvette
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多谢westernblot战友的回复。现在问题是所得到的序列和别的物种的Mx基因虽然有一定的同源性,但是,同源性实际上是很低的。比如,与gi|38081550|ref|XM_358891.1|MusmusculussimilartoMyxovi...440.13(小鼠的Mxgene)BLAST的score只有44。我不知道如何用这个序列作蛋白质预测,这只是CDNA中随机的一段序列,无法知道起始密码子及读码框,那么该怎样预测,预测的结果又能说明什么问题呢?还请您不吝赐教。
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jiangxue329
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我不知道如何用这个序列作蛋白质预测,这只是CDNA中随机的一段序列,无法知道起始密码子及读码框,那么该怎样预测将你的cDNA序列提交到http://au.expasy.org/tools/dna.html该程序会按照六种可能的阅读框架给出对应的氨基酸序列。得到蛋白序列之后,再运行blastp,看看蛋白之间的相似性有多少,仅仅依据核苷酸的相似性判断是不够准确的。
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ppcat
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我以前用兼并引物克隆的植物基因在BLAST里比对的时候竟然找到的都是老鼠和人的,实际上我得到的基因的确是我想要的,我们实验室其它同学也遇到过这个问题,可见BLAST比对的DNA结果并不全面和准确,所以我建议你继续做下去,至少做出3‘然后比对蛋白质序列,这样可靠性高些。
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yvette
  用户
多谢以上诸兄弟,听君一席话,胜读三个晚上的书。不过我纳闷的是PPCAT在用简并引物扩出来的片段BLAST不出来,如何知道作出来的是您所要的基因?一般在文献上也没讲这个问题,比如说吧,要用我以上所说的方法克隆一个GENEFAMILY的基因,那么如何判定得到的全长CDNA就是该FAMILY的基因呢?至少要进行BLAST及MOTIF预测吧,那么,BLAST同源性至少达到多少就可以认定呢?有没有一个通常的标准呢?是不是含有该FAMILY的MOTIF就可以认定得到的cDNA就是想要克隆的该FAMILY的新基因?
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