| 实验步骤 | 通过重组PCR产生2A连接的多顺反子可读框材料试剂 适合纯化DNA的琼脂糖凝胶 煮沸2〜3min在IXTAE中溶解高纯度的琼脂糖。55°C水浴直到温度平衡。加3〜5MEB。胶凝后，IXTAE充满容器，去掉梳子。超过500bp片段的使用1%琼脂糖胶。较小产物，琼脂糖浓度提高2%。 克隆载体 有很多不同类型商业化载体编码不同选择可读框、抗生素抗性基因、荧光蛋白。重要的是确定所有载体系统检测不到2A多肽介导的「切割」，然后考虑克隆策略。 产物长度，模板中GC比例，引物Tm影响酶的选择。我们一般使用Advantag^HF2PCR试剂盒（Clontech)，可以一致的产丰3kb产物低的突变率。其他髙忠实性酶（八如£^昭^GC,Clontech;PhusionHigh-FidelityDNA聚合酶，Finnzymes;扩增长的模板，RocheAppliedScience)，这些试剂都成功地在我们实验室使用，选择依赖于使用的模板和引物长度，根据操作手册使用。 DNA大小标志 dNTP 准备10mmol/LdNTP、无菌水溶解、PCR级别去离子水6分装保存一80°C长期（>2月） —20°C(<2月） EB(10mg/ml) 加IgEB到IOOml去离子水中，搅拌数小时直到完全溶解。室温保存到不透光瓶子中。IOX琼脂糖胶上样缓冲液（例如，0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯菁FF、水溶解50%甘油） H2OPCR级别 PCR引物寡核苷酸 PCR级别无菌水准备工作浓度20umol/L，分装保存-20°C 模板DNA 酶PCR用IOOng质粒DNA或CDNA。 50XTAE(Tris/Acetate/EDTA) 溶解242gTrisS57.Iml冰乙酸，IOOml〇.5mol/LEDTA(186.IgEDTA•2H20二钠，加水到1L，调pH到8.0),用去离子水稀释到IXTAE使用。 仪器 用3〜5mm的梳子上样消化液。大的上样量用于胶回收。所以推荐用7〜10mm宽齿梳子。 PCR纯化或胶回收试剂盒 PCR仪 薄壁PCR管 紫外灯 方法 1.为产生初始PCR产物，准备如下反应： 聚合酶缓冲液5.0ul 和终止密码子序列而不是包括2A的序列（图3)。 对于重组PCR改变复性温度不是必需的。延伸时间相应的延长引物产物的质量增大。重组PCR可以使用超过两个PCR产物，条件是片段之间的重叠序列不同，每个片段摩尔量相同。如果试验产生重组产物比较困难，分几个阶段重组PCR反应，每个阶段使用2〜3个初始模板，直到产生全长的产物。要知道，增加PCR循环数会提高出错概率。 7.如步骤3检测产物分子质量，如步骤4纯化产物。 8.限制酶酶切延伸引物中酶切位点，克隆终产物到表达载体中。 9.使用感兴趣的表达基因或载体特异性引物测序。重要的是要确保2A多肽序列正确，因为任何氨基酸组成改变会影响切割效率 检测2A多肽切割材料试剂 抗蛋白质或2A抗体 DMEM培养基 完全培养基和无血清培养基。完全培养基添加了10%胎牛血清、2mmol/LL-谷氨酸、1mmol/L丙酮酸钠、100umol/LMEM非必需氨基酸、5mmol/LHEPES、5.5x10-5单位的β-巯基乙醇、lOOU/ml青霉素和lOOug/ml链霉素。另外，20ug/ml环丙沙星 裂解液（如诺乃洗涤剂-P40或RIPA裂解缓冲液，参见HarlowandLane1999) 磷酸盐缓冲液（PBS) 质粒DNA 许多转染试剂可用，但是我们发现转染293T细胞使用TmnsIT-LTl、TmnSIT-293T(Mims、MADIson、Wisconsin)或者FuGENE6转染试剂（Roche)。如果没有这些试剂，使用磷酸钙转染同样可以。 胰酶/乙二胺四乙酸 293T是贴壁细胞；使用胰酶EDTA可以促使细胞脱离培养板减少细胞成团 指数生长293T细胞 仪器 SDS^PAGEWestern杂交仪 标准组织培养仪，包括IOOmm板 这个方案设计针对293T细胞IOOmm组织培养板培养。如果使用不同大小培养板培养细胞，适量调整细胞密度和试剂用量。 方法 1.转染前24h胰酶消化收集细胞。 a.去除贴壁细胞培养基（DMEM)，PBS冲洗去除痕量培养基，加3〜4ml胰酶EDTA。 b.室温孵育2〜3min，直到细胞从培养板脱落。轻轻重悬细胞转移到圆锥管中，IOml完全培养基洗板，转移冲洗培养基到管中，中和胰酶。 c.lOOOr/min离心lOmin。去除上清，5ml培养基重悬沉淀，细胞计数。接种细胞到IOOmm组织培养板浓度2XIO6个细胞/板，加IOml培养基。37°C过夜使细胞贴壁。 2.根据操作说明，选择试剂转染细胞。使用1〇ug载体/板，37°C孵育细胞48h以上。 3.如步骤1一样，胰酶消化收集细胞。 4•检测切割，溶解细胞，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，Western杂交。封阻和探针选择适合靶蛋白质的标准程序。如果有研究蛋白质的抗体Western杂交有效，可以用来检测切割的效率。2A多肽的抗体没有商品化产品，但是可以自己制备。根据蛋白质分子质量，它们可以鉴定感兴趣蛋白质从切割和非切割材料中区分开。 转染有多重顺反子载体细胞表达的蛋白质可以与编码单独蛋白质粒转染细胞对比。要知道，2A标签会引起蛋白质分子质量的微小变化 |
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