| 实验方法原理 | 在生物医学研究中，培养的哺乳动物细胞是被广泛使用的材料。本方案中介绍的方法已经成功用于许多人类克隆的癌细胞系和纤维原细胞系（Ji,etal，1994,1997)。虽然多数细胞蛋白质能用此方法提取，但是一些DNA结合蛋白可能会丢失。 如果研究DNA结合蛋白，应该使用核酸酶，此方法在方案3中详述。表达蛋白质组学的研究经常需要检测低丰度蛋白质，一种检测微量蛋白质的更可靠、更敏感的方法是对细胞蛋白质进行代谢物放射性标记，此方法的详细介绍见附加方案：用放射性同位素标记真核生物细胞蛋白质。具体步骤详见本方案的最后。 | ||||||
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| 实验材料 | 培养细胞（贴壁或悬浮) 试剂、试剂盒 | 抽提缓冲液IPG缓冲液磷酸盐缓冲液 仪器、耗材 | 细胞刮刀离心机（低温、低速）滤纸冰浴装置超速离心机（低温）旋涡混合器 实验步骤 | 1.从培养皿中转移细胞。. 如果是贴壁细胞，用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞，用5ml吸管将细胞和培养基转移到15ml离心管中。 如果是悬浮细胞，直接将细胞和培养基转移到离心管中。 2.480g、4°C，离心沉淀细胞5min。 3.弃去上清，勿搅动沉淀。
4.在离心管中加IOml冰冻PBS洗涤细胞，来回吹打重悬细胞。 5.480g、4°C，再次离心细胞5min。 6.弃去上清，勿搅动沉淀。 7.重复步骤4~6两次。 8.在最后一次洗涤后，把离心管完全空干，用滤纸将沉淀上残留的PBS吸干。 9.用吸管将抽提缓冲液加到离心管中。 依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。细胞裂解液的蛋白质浓度应为10mg/ml，不应超过20mg/ml。 10.旋涡混合器振荡离心管10~30s，重新悬浮沉淀。 11.每1Oml抽提缓冲液中加50ulIPG缓冲液，IPG缓冲液终浓度为0.5%。 12.将细胞裂解液转移到一个合适的超速离心管中。 13.100000g离心20min。 14.收集上清，小心避免试管底部的清澈黏性的液滴（DNA和RNA)混入上清。 15.用BCA方法测定蛋白质浓度（见附录2)。
16.将上清分成几等份，每份lOOjtxl或200沁。 每一等份的大小取决于待测样品的量。如果不立即用于IEF，将样品储存在一80°C。 17.按方案5进行第一向IEF。 |
