| 实验方法原理 | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 蛋白质溶液 仪器、耗材 | 毛细管电泳仪 实验步骤 | 「操作条件选择」具体见「其他」 1.毛细管电泳柱的制备：清洗、反应与柱平衡； 2.移开进样端的缓冲溶液池，换上样品管； 3.使用低压或电迁移方式进样； 4.再换上缓冲溶液池； 5.施加分离所需的电压。进行电泳分析。 注意事项 | 展开 其他 | 操作条件选择 1.毛细管尺寸 最常用的为内径为25～75um熔融石英毛细管，从分析时间上考虑，毛细管应尽可能得短，常用的有效长度（进样端至检测窗之间的距离）为20～50cm。 2.高压电源 HPCE所用的高压电源要能提供30kV的直流电压和200～300uA的电流。欲获得迁移时间的高重现性，须使电压稳定在±0.1％。电源极性应能切换。恒压方式最为常用，当进行等速电泳或温度不能很好控制时，则应采用恒流或恒功率方式，从而获得恒定的迁移时间。 3.温度控制 由于进样和迁移时间决定于溶液的黏度，应将温度控制在±0.1℃，这对于操作的重现性是很重要的。采用液体恒温较气体恒温更为有效。 4.进样量 样品区带长度应该小于毛细管长度的1％～2％。样品超载会使峰变宽，峰形畸变。 5.进样方式 采用流体力学的方式，进样量基本不受样品基质的影响；电迁移进样时，进样量决定于每一个组分的电泳淌度，应注意歧视效应带来的影响。 6.样品预浓缩 在等速电泳和等电聚焦分析中，样品在稳态时可被浓缩许多倍，有利于紫外检测分析，但在毛细管区带电泳中，样品区带会展宽，因此常需要采用样品堆积、等速电泳和色谱法，通过对低电导介质的电动进样或压力进样来达到样品堆积的目的。非连续的缓冲系统被用于柱上低浓度样品的浓缩，进样体积较常规方法要大30倍。采用整个毛细管进样技术，样品可以浓缩400～1000倍。 瞬态等速电泳浓缩既可采用典塑的等速电泳电解质系统，也可以在样品中补充高淌度的与分离的样品电荷符号相同的离子（co-ion），而电解质的同号离子具有低淌度。在电泳过程中，由等速电泳模式逐渐转变为区带电泳模式。 色谱法预浓缩是先将样品捕集于一反相或亲和填料，然后用少量溶剂洗脱下来，同时使样品得到净化，如蛋白G和结合亚胺二乙酸金属螯合功能团的固定相。采用很低浓度的缓冲液和孔径非常小的聚丙烯酰胺凝胶进行浓缩，样品中的水扩散入凝胶，盐分同时被脱除，可适用于少量样品的处理。 |
