实验材料 | 蛋白质样品 试剂、试剂盒 | 变性剂二硫苏糖醇Ellman试剂碘乙酸氮气反应缓冲液4-乙烯基吡啶 仪器、耗材 | 透析系统尺寸排阻层析装置分光光度计和小试管 实验步骤 | 方法1:自由巯基1.加人3ml反应缓冲液到样品管和对照小试管中。 2.在412nm测定吸收值(吸收值应该调节至0,Abuffer)。 3.加人100ul反应缓冲液到对照小试管中。 4.加人100ulEllman试剂到样品小试管中,在412nm测定吸收值(Adtnb)。 5.加入1000蛋白质溶液到对照小试管中。 6.加人100ul蛋白质溶液到样品小试管中,混匀,3~5min后测定吸收值,直到其值不再增加。记为Afinal。 7.根据以下公式计算巯基的浓度: 方法2:二硫巯基本方法除了蛋白质样品首先要烷基化(无需预先还原),以得到自由的巯基(但保持二硫键完整)以外,基本与方法1相同。可以通过碘乙酸或4-乙烯基吡啶进行烧基化(见方案2)。 1.把样品溶解在反应缓冲液或者变性缓冲液中(在100ul中至少含有2nmol)。 2.加人新鲜制备的DTT(终浓度为10~100mmol/L),用氮气流代替氧气,25°C反应1~2h。 3.通过透析或尺寸排阻层析,对还原后的样品进行脱盐。 4.测定蛋白质浓度(基本实验流程,见附录2),用方法1中描述的步骤分析新暴露出来的巯基。 |
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