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方案4用Ellman试剂测定自由巯基和二硫键实验资讯...
来自 : 蚂蚁淘
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

方法1:自由巯基

1.加人3ml反应缓冲液到样品管和对照小试管中。

2.在412nm测定吸收值(吸收值应该调节至0,Abuffer)。

3.加人100ul反应缓冲液到对照小试管中。

4.加人100ulEllman试剂到样品小试管中,在412nm测定吸收值(Adtnb)。

5.加入1000蛋白质溶液到对照小试管中。

6.加人100ul蛋白质溶液到样品小试管中,混匀,3~5min后测定吸收值,直到其值不再增加。记为Afinal

7.根据以下公式计算巯基的浓度:

方法2:二硫巯基

本方法除了蛋白质样品首先要烷基化(无需预先还原),以得到自由的巯基(但保持二硫键完整)以外,基本与方法1相同。可以通过碘乙酸或4-乙烯基吡啶进行烧基化(见方案2)。

1.把样品溶解在反应缓冲液或者变性缓冲液中(在100ul中至少含有2nmol)。

2.加人新鲜制备的DTT(终浓度为10~100mmol/L),用氮气流代替氧气,25°C反应1~2h。

3.通过透析或尺寸排阻层析,对还原后的样品进行脱盐。

4.测定蛋白质浓度(基本实验流程,见附录2),用方法1中描述的步骤分析新暴露出来的巯基。

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