| 实验方法原理 | 对于分离宽分子量范围的蛋白质，梯度SDS-PAGE凝胶可提供最佳分析方法，产生更清晰的蛋白质点。通过减少凝胶中孔的尺寸，可使扩散减少。但是，梯度凝胶重复性较差，所以通常用多凝胶灌制装置来同时灌制，制作一套凝胶来进行同一系列的实验。下面讲述用多凝胶灌制系统灌制梯度凝胶的方法。 如果凝胶要用银氨方法（方案11)来染色，凝胶中的硫代硫酸钠可减少染色背景（HochstrasserandMerril,1988;见表4.6注释）。 | ||||
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| 试剂、试剂盒 | 过硫酸铵（10%)正丁醇乙醇4X凝胶缓冲液凝胶储存液单体胶储液SDS(10%)5XSDS电泳缓冲液TEMED蔗糖 仪器、耗材 | 玻璃平板梯度制备仪磁力搅拌子磁力搅拌器多梯度凝胶灌制盒蠕动泵吸管夹子隔片真空瓶水抽真空泵或其他抽真空系统 实验步骤 | 1.安装玻璃板之前，用乙醇浸过的无棉纸巾擦拭玻璃板，确保无灰尘颗粒粘在玻璃板表面。
2.对齐两块玻璃板，在两边放入1.0mm或1.5mm隔板。 3.用不脱色的记号笔标记玻璃板距上沿0.5cm处，在一些系统例如Bio-RadProteanII，玻璃板不等长，应确保标记距短板上沿0.5cm。 4.用打字机或铅笔标记一小条滤纸作为凝胶的标签。将滤纸放在凝胶框的左边底部。不要用记号笔，因其会渗人凝胶。 5.将整个凝胶框放人多凝胶灌注架中，同样将其他的凝胶框排列放于灌注架上，用薄塑料片（即隔板）将各凝胶框分隔开。这些薄片通常由多凝胶灌注架提供，但也可用聚酯薄膜板切割而成。用灌注架提供的隔板填充各个空格。夹紧灌注架上前面的玻璃板以确保垫片将灌胶空间密封好。 6.灌胶之前，向灌胶的空间加水来确定所需试剂的体积，测量体积的一半用于制备低（轻溶液），另一半用于制备高（重溶液）。用表4.6来计算灌胶中各个成分的体积。 7.制备准确体积的轻、重丙烯酰胺溶液，过硫酸铵与TEMED的体积忽略不计，各加一个小的磁力搅拌子。 8.用水抽真空泵来抽去丙烯酰胺中的气体（几分钟），同时在磁力搅拌器上搅拌。 虽然并非所有研究者都进行这步抽真空，但为了更佳的重复性，建议进行此步操作。 9.当溶液在抽真空时，将一根管子连到蠕动泵，先用水检验以确保制造商所建议泵的流速。一旦流速固定，将管一端连在梯度混合器的出口，另一端连到多块凝胶灌注仪的人口。在多块凝胶灌制装置的开口端放一个夹子，打开夹子，确保梯度混合器处于关闭的状态。 10.在混合器中将小磁力搅拌子放人，将梯度混合器放在磁力搅拌器上。 |
