| 实验材料 | 含有目标蛋白的细胞提取物 试剂、试剂盒 | 琼脂糖凝胶脱色液凝胶染色液甘油2X上样缓冲液SDS-聚丙烯酰胺凝胶 仪器、耗材 | 玻璃纸锥形瓶凝胶电泳装置微量离心过滤装置小型离心机微波炉Ultrafree-DA装置 实验步骤 | 一、非变性凝胶的制备
（1）将琼脂糖粉末加到有3?4倍体积的非变性凝胶缓冲液的锥形瓶中，称重。 （2）用倒置的烧杯盖住锥形瓶，放到微波炉中加热，直至琼脂糖熔化。 （3）再称重，如必要加水补到原来的重量。 （4）让琼脂糖在45°C水浴中冷却。 （5）把梳子插到凝胶灌制装置中央，倒入琼脂糖溶液。 （6）让琼脂糖凝固。 （7）把凝胶放入装有非变性凝胶缓冲液的水平电泳装置中，保证凝胶完全浸没。 小心拔出梳子。 二、蛋白质复合体的鉴定2.用纯化的蛋白质在有利于蛋白质复合体形成的条件下，共同温育目标蛋白。 要确定细胞提取物中的蛋白质是否能与目标蛋白结合。在适于形成蛋白质复合体的条件下，取45]ug溶解的细胞提取物与5ug的纯化蛋白一起温育。 3.用2X上样缓冲液以1:1(体积比）混合蛋白样品，每份2~5ug。 蛋白样品应该包括每个单独蛋白（或使用的细胞提取物），在第②步骤中将混合物孵育。 4.加样到加样孔中（一般约20ul孔），室温下恒压50V电泳lh。 5.在染色液中，染凝胶20min。在脱色液中脱色，直到能清晰地辨别蛋白条带(图10.16)。 6.在甘油中泡5min，37°C在两层玻璃纸间干燥24h以干燥凝胶。 三、蛋白质复合体的组分的分离和鉴定7.在相邻泳道中，加2个相同的蛋白质复合体样品到0.8%琼脂糖凝胶，室温下恒压50V电泳lh。 8.用锋利的刀片从凝胶上分离2个泳道的凝胶。 9.按步骤⑤染2个泳道中的一个泳道胶条。另一个泳道的胶条浸在非变性凝胶缓冲液中（缓冲液A)。 10.鉴定含有蛋白质复合体的染色凝胶区域。从对应蛋白质复合体位置的未染色凝胶区域，切下琼脂糖条带，作为染色凝胶参照。 11.把含有复合体的未染色凝胶碎片放入Ultrafree-DA装置中。装置中的凝胶喷雾器能通过离心，把凝胶条转化成细小的喷雾。把过滤装置放到滤瓶中，室温或4°下5000g离心lOmin。凝胶碎片必须通过喷雾器的口，以便将凝胶转变为细小泥浆。 凝胶颗粒通过过滤器被捕获，然后弃掉（过滤器不可重复使用）。 12.将过滤瓶中的蛋白质样品转移到微型超滤浓缩器中（所用的截点大小，由所研究的蛋白质的大小决定）。 13.14000g离心微量浓缩器，直至样品体积剩到10~20ul。 蛋白质保留在微量样品储存池的膜上。 14.把微量管倒置在新的瓶中，回收浓缩蛋白质。l000g离心3min。 细节参见供应商的说明书。 15.鉴定蛋白质复合体条带各组分的大小，用SDS-PAGE分析浓缩的蛋白质（见第2章方案1)。 凝胶中丙烯酰胺的百分比，取决于要研究的蛋白质的大小（见第2章表2.2)。 或者，可用ESI-MS或MALDI-MS分析蛋白质（要求约4Pmol)(见第8章）。 |
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