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| 实验方法原理 | 带电质在电场中向与其极性相反的方向流动的现象称为电泳．血清中各蛋白质都有不同的等电点，当将其置于比其等电点高的PH缓冲液中时，他们都将带负电荷在电场中向正极泳动．由于各蛋白质等电点及所带电荷量和分子量大小都有所不同，因而在电场中泳动速度不同，利用这个特点将血清中各种蛋白质分开． | ||||||
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| 实验材料 | 醋酸纤维素膜 仪器、耗材 | 电泳仪电泳槽血清加样带分光光度计滤纸剪刀
实验步骤 | 实验仪器：电泳仪电泳槽血清加样带分光光度计滤纸剪刀 实验材料：醋酸纤维素膜规格2×8cm。 实验试剂： l.巴比妥－巴比妥钠缓冲液（PH8.6＋0.1.离子强度0.06）：称取巴比妥2.21g，巴比妥钠12.369于500ml蒸馏水中，加热溶解，待冷至室温后，再用蒸馏水补充至于1L。 2.氨基黑10B染色液：称取氨基10B0.1g，溶于无水乙醇20ml中，使溶解。另取磺基水杨酸2.5g，溶于74.5ml蒸馏水中，再将二液混合摇匀。 3.漂洗液：甲醇45ml，冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，摇匀． 4.0.4M氢氧化钠溶液。 实验操作： 1.将缓冲液加入电泳槽内，调节两侧槽内的缓冲液，使其在同一水平面上。 2.醋纤膜的准备：取在缓冲液中浸泡的醋纤膜一张，在毛面的一端（负极侧）1.5厘米处，用铅笔画一横线，作点样标记，编号后，将醋纤膜置于巴比妥－巴比妥钠缓冲液中浸泡，待充分浸透后取出（一般为二十分钟）夹于洁净滤纸中间，吸去多余的缓冲液。 3.将醋纤膜毛面向上贴于电泳槽的支架上拉直，用微量吸管吸取无溶血血清在横线处沿横线加3－5微升。样品应与膜的边缘保持一定距离，以免电泳图谱中蛋白区带变形，待血清渗入膜后，反转醋纤膜，使光面上平直地贴于电泳槽的支架上，用双层滤纸或四层纱布将膜的两端与缓冲液连通，稍待片刻． 4.接通电源，注意醋纤膜上的正负极，切勿接错．电压90－150伏，电流0．4－0.6mA/cm宽（不同电泳仪所需电压.电流可能不同，应灵活掌握）；夏季通电45分钟，冬季通电60分钟，待电泳区带展开约25－35mm。，即可关闭电源。 5.染色：通电完毕，取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色5－10分钟（以白蛋白染透为止），然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。 6.定量：将漂洗净的薄膜吸干，剪下各染色的蛋白区带放入相应的试管内，在白蛋白管内加0.4M氢氧化钠溶液6ml（计算时吸光度乘2），其余各加3ml，振摇数次，置37度水箱20分钟，使其染料浸出.对于浸出的氨基黑10B，用分光光度计，在波长600－620nm读取各管吸光度，然后计算各自的含量（在醋纤膜的无蛋白区带部分，剪一条与白蛋白区带同宽度的膜条，作为空白对照）． 计算： 各组分蛋白％=Ax／At×100％ 各组分蛋白g/L＝各组分蛋白百分数×血清总蛋白g/L AX表各组分蛋白吸光度At表各组分蛋白吸光度总和 参考值：  注意事项 | 失败原因： 1.电泳图谱不整齐：点样不均，薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发，缓冲液变质：电泳时薄膜放置不正确，使电流方向不平行． 2.蛋白组分分离不佳：点样过多，电流过低，薄膜结构过分细密，透水性差，导电性差等． 3.染色后白蛋白中间着色浅：由于染色时间不足或染色液陈旧所致：若因蛋白含量高引起，可减少血清用量或延长染色时间，一般以延长2分钟为宜．若时间过长，球蛋白百分比上升，A/G值会下降． 4.薄膜透明不完全：温度未达到90度以上将标本放入烘箱，透明液陈旧和浸泡时间不足等。 5.透明液上有气泡：玻璃片上有油脂，使薄膜部分脱开或贴膜时滚动不佳． 免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
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发布于 ： 2018-08-05
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