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biosttia是一家总部位于圣地亚哥的公司，提供分子生物学产品和服务，支持全球的研究人员。利用我们高效的慢病毒系统，我们协助许多学术机构、生物技术和制药公司进行基因表达和抑制相关研究。Biosettia专门从事：shRNA载体系统的基因沉默慢病毒miRNA对基因的抑制作用慢病毒miRNA的功能筛选miRLocker–慢病毒miRNA抑制慢病毒的制备慢病毒基因表达诱导多能干细胞生成核酸纯化
RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA（dsRNA）使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性（下面讨论），通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。[放大]图1. siRNA和shRNA结构。（A）siRNAs是短的RNA双链，在3‘端有两个碱基的游离。（B）shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。（C）shRNA构建用于插入表达载体。源自[1, 2]。背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年，Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而，直到1998年，Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果，他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。
表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。术语描述siRNA小干扰（siRNA），有在3’端有两个碱基的游离，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。shRNA短发夹RNA（shRNA），包含一个环结构，可加工成siRNA，也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.Drosha是一种核糖核酸酶III的酶，可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。Dicer核糖核酸酶III酶，能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA，而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用RISC最小RNA诱导沉默复合物（RISC）包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。TRBPDicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要PACT蛋白R（PKR）-激活蛋白（PACT）。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关.Argonautefamilyofproteins和单链的RNA（siRNA）共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA，包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA，然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链（引导链）RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。表一：RNAi机制的主要组成元件。siRNA vs. shRNA作用机制两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA（siRNA）和基于载体的短发夹RNA（shRNA）。虽然siRNA和shRNA（图1）都可用于蛋白沉默，但它们的作用机制有所不同（图2）。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中（参见转运机制获取更多细节）。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的，但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物，双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合，RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5"端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中。[放大]图2. RNAi介导的基因沉默机制。在细胞核表达后，shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中，在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上，它们与siRNA的加工方式（以短的双链形态导入细胞，然后被Dicer识别）相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后，它们识别mRNA占有互补序列，导致其降解。源自[3]。shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成，形成发夹结构，茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起（图1b和1c）。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制，shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体，shRNA被导入靶细胞的细胞核内，在某些情况下，载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除发卡结构，产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分，siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA，从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点，siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物，而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA，然后由Dicer酶加工，形成正反馈循环，增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。该过程图2中有阐述。人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而，Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出，RISC不是作用于未折叠的RNA。他们提出了一个模型，在该模型中，RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触，5"末端碱基配对比3"末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。
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荧光燃料使用的问题有两个：
一个就是迁移性，使用时要严格控制用量，以避免产生迁移现象；
二是荧光染料使用有一个极限值，如果超量使用，导致荧光线被吸收，使吸收和发光成叠所致。
希望同路人多多交流啊!
然后是碱性荧光染料，造纸厂用来增加纸的亮度。
直接和分散的荧光黄，印染厂用来增加棉质和化纤面料的艳度
随着免疫荧光技术的不断发展，荧光染料及其标记的抗体偶联物也被广泛的应用于生物学实验中。目前，市场上抗体及蛋白标记的荧光染料主要有CFTM系列(Biotium,USA);AlexaFluor®系列(Lifetechnology,USA);DyLight系列;Cy系列;IRDye系列等等。使用最多的为AlexaFluor®系列和CFTM系列。
一、CFTM系列染料的核心对比AlexaFluor®系列具有以下几点优势：
1、新型罗丹明核心
罗丹明染料以优异的耐光性和良好的荧光量子产量著称。因此很多AlexaFluor®染料具有罗丹明核心结构，但是，传统罗丹明的化学结构很难从长波长的荧光染料延伸至远红外区域甚至是更具挑战性的近红外区域，而且生物偶联后其水溶性并不理想。Biotium科学家发现从绿色到近红外多色荧光的罗丹明染料的新型化学方法。该方法被有效的应用于CF染料的产品中，尤其是远红外CF染料，而且通过这种方法制备的染料不仅水溶性极佳而且耐光性极好。
2、特异性高的近红外染料
近红外染料最大的特点是比可见光范围要大很多，大滴的染料常会导致染料水溶性低、染料聚合体多、荧光量子产量差等问题。为了解决这些问题，许多商用的近红外染料比如AlexaFluor®、DyLight®dyes和IRDyes®近红外染料，在制备时吸附了大量的带负电荷的磺化基团，其磺化作用可以在一定程度上会提高染料的溶解性和荧光性，但这样也带来了另一些更加严重的问题，经这种染料标记的生物耦联物的非特异性结合。Biotium的科学家用**性的方法设计出近红外染料CF，在避免引入大量负电荷的情况下，极大的保证了染料优异的理化特性。Biotium近红外的CF染料以花青或罗丹明染料为核心结构，该核心结构的特殊化学修饰限制了染料的分子内位移，从而获得染料的高量子产率和更好的水溶性。因此，近红外CF染料比其他近红外染料荧光强度更高，光稳定性好。最重要的是，在免疫印迹实验上应用近红外CF染料标记蛋白质样品相对于其他商业用近红外染料制备的抗体偶联物，最大限度的提高了信噪比。
3、优异的标记效率
生物偶联后的活性染料一般很容易水解，会在运输，操作及储存中带来诸多不便，最终致染料结合效率低下。像AlexaFluor®dyes,DyLight™dyesandIRDyes®等严重的磺化作用有较强的吸湿性，恶化水解作用等问题。所有Biotium的CF染料具有相对稳定的胺活性的SE基团型，这比大部分AlexaFluor染料的SE更耐水解。总体来说，CF染料SE产品一贯的给出更高的标记效率，提供给用户更好的使用价值。
二、选择方案：
1、蓝色（350-450nm处激发）
CF350、AlexaFluor350、AMCA等----亮蓝和紫外光激发。
CF350是类似于AlexaFluor350和传统荧光染料AMCA的蓝色荧光染料，CF350的荧光强度高于AlexaFluor350、AMCA，吸附在蛋白上的荧光超过50%，水溶性更好，耐光性非常优秀亮，更容易与现有的绿色荧光基团区分。
CF405S/CF405M、AlexaFluor405----近乎完美的匹配蓝色二极管激光器。
CF405S/CF405M、AlexaFluor405与近来使用的荧光显微镜和流式细胞仪405nm;谱线的蓝色二极管激光器完美的匹配。在流式细胞仪上的分析结果显示CF405S/CF405M荧光信号强度高于AlexaFluor405染料1.7倍。
2、绿色（488nm处激发）
CF488A、AlexaFluor488、FITC、FAM、DyLight488、Cy2等----针对488nm氩离子激光器的绿色荧光染料。
以上染料其标记的抗体蛋白适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪，流式细胞仪的FL1通道检测，或者可用于荧光显微镜技术。
CF488A最低限度的带电量降低了与抗体耦联物的非特异性结合，在红色通道溢出少于AlexaFluor488，耐光性好、水溶性好和pH不敏感，良好的稳定性和活性染料的标记率。
AlexaFluor488在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4~10）；
FITC激发波长488nm，最大发射波长525nm，缺点：荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。
3、橙红色（543-555nm处激发）
CF543、AlexaFluor546、ATTO550,Cy3,DyLight549,Rhodamine(TRITC)匹配543nm的橙色荧光染料；
CF™543荧光条带明亮，耐光，水溶性好，确保了CF543染料与抗体的耦联物保持优异的水溶性，为该波段最亮的橙色荧光染料。例如：同等的标记程度下，CF543标记的羊抗鼠IgG抗体的亮度高于用AlexaFluor546标记的2~10倍。
CF555、AlexaFluor555、Tetramethylrhodamine(TAMRA)等匹配Cy3滤光片的橙色荧光染料。
4、红色（568-594nm处激发）
CF568、AlexaFluor®568,ATTO565,RhodamineRed等568nm处红色荧光染料。
CF568染料耐光性最好；高效水溶性；比AlexaFluor568标记的抗体亮度更亮。
CF594、AlexaFluor®594,ATTO™594,DyLight™594,TexasRed等最亮红色荧光染料。
CF594由于其高量子产量和优异的水溶性而比AlexaFluor594明亮2~4倍。同时CF594对光极其稳定，使它能被理想地应用于诸如共聚焦显微镜和单分子显像条件苛刻的应用中去。
5、远红外（620-660nm处激发）
CF620R、LightCyclerRed640等620nm处。
CF™620R是以红色荧光染料罗若丹（rhodamine）为基础的远红外的荧光染料，该染料有高荧光亮度和极度的耐光性。它的吸收和发射光谱为617和639nm，该染料能被用于荧光能量共振转移中高能量的接收者，或者在激发和发射窗口能和该染料的光谱特性匹配的条件下，被应用于多色检测中的最高荧光量采集。染料的卓越的水溶性有利于生物耦合在水介质中，更好的保持耦联物的生物特异性结合。
CF633、AlexaFluor633,AlexaFluor647,Cy5,DyLight633,DyLight649等633/635nm激光线的最佳染料荧光染料。
CF633染料的优点：当被633nm氦氖激光或635nm红色二极管激光激发时，产生最亮的抗体耦联物，光稳定性远高于AlexaFluor647，高效的水溶性。
CF640、AlexaFluor647,ATTO647N,Cy5,DyLight649等远红外荧光染料。
CF640R的优点：以红色染料罗丹明（rhodamine）为基础，吸收和发射峰类似Cy5、AlexaFluor647；但以罗丹明（rhodamine）为基础的红色染料CF640R它最大的优点就是对光稳定性，Cy5和AlexaFluor647以花青素为基础，因此有着和花青素一样的特点即耐光性较差。极好的亮度和耐光性使CF™640R被理想的用于共聚焦显微镜和单分子成像等条件苛刻的检测中。
CF647、AlexaFluor647,ATTO647N,DyLight649等远红外荧光染料。
以花青素为基础的远红外荧光染料CF647比Cy5、AlexaFluor647明亮。
CF660、AlexaFluor®660,Allophycocyanin(APC)等介于远红外近红外之间的荧光染料。
6、近红外（680-790nm处激发）
CF680R/680、AlexaFluor680,Cy5.5,IRDye680等近红外荧光染料。
CF680是高水溶性的以花青素为基础的染料，分子量大约为3000。该染料标记抗体极佳，发出最亮的荧光和在免疫染色光谱相似的染料中产生最高的信噪比。
CF680R分子量约为900，更适合标记核酸或者相对小的生物分子。CF680R是新型的以罗丹明（rhodamine）为基础的高荧光亮度,极度耐光性染料，这使它可被理想地用于共聚焦显微镜，单分子成像等条件要求苛刻的应用中。
CF750、CF™770andCF™790等近红外荧光染料。
CF750、CF770、CF790是领域内真正具有突破性的长波长的新型染料代表。其他近红外染由于受到染料聚集和稳定性差等因素的影响而导致荧光亮度有限。基于Biotium科学家研制的新型分子工程技术，近红外CF染料克服了这些问题。即使在633nm被激发，CF750也会比APC-AlexaFluor750拥有足够的亮度来在流式细胞仪检测中带来更好的信噪比，而且不存在串联染料的低稳定性等问题。另外，近红外CF染料高度水溶性，没有会增加抗体耦联物非特异性结合的过剩的负电荷，也代表了该产品的优秀性能。
我想用共聚焦观察间期染色体，用涂染探针，有一个问题很困扰我，我想涂染完染色后用DAPI复染细胞核，但是目前哈尔滨的共聚焦都没有紫外激发光，不能激发DAPI，我怎么才能实现，用红色涂一条染色体，用绿色涂另一条，用DAPI蓝色染核，同时成像呢，所说的双光子显微镜可以么？我实在很迷惑，求求版主别再删我的帖子，尽管我现在只是一个索取者，还不能给大家提供有用的信息，但是相信有一天会为大家做贡献的，谢谢了
想请问一下，DAPI这个染料到底有没有膜通透性，我通过百度搜索查询关于DAPI染料的，基本上是说它能透过细胞膜对活细胞和死细胞均能染上蓝色；但是也有人说DAPI只可以透过死细胞膜，不能对活细胞进行染色，用以区分活死细胞，到底哪个是对的啊，蒙了！！！！！！
