β-半乳糖苷酶活性的整体封片免疫组化检测实验 β-半乳糖苷酶活性的整体封片免疫组化检测实验 免疫组化 精编分子生物学实验指南第五版第十四章
来源：《精编分子生物学实验指南》第五版 1 收藏 0 阅读1)在冰冷的PBS里解剖胚胎或组织。置β-半乳糖苷酶固定剂，室温至合适的时间。以下是固定小鼠胚胎和组织的指导：外植体和E 6.5到E 7.5胚胎5〜10 min； E 8到E 9.5胚胎或尾巴切面 15〜30 min； E 10 到 E 12.5 胚胎 30 min〜1.5 h; E 13 到 E 14.5 胚胎 2 h; E 15.5 或更大的组织则需要解剖出来或切一半，然后固定2 h。新生幼鼠或更大的小鼠的灌注需要在解剖特定组织染色之前进行。
2) 用β-半乳糖苷酶洗涤缓冲液室温洗涤3次，每次15 min (针对小胚胎或尾巴切面）， 或每次30 min (针对Ell胚胎和大组织），头尾相接地轻柔转动。
3) 将组织置于β-半乳糖苷酶染色液中（室温，30℃或37℃取决于β-半乳糖苷酶表达丰度），在一5 mL或10 mL的帽盖的试管或1. 5〜2 mL的离心管中孵育，以防止蒸发。可以用肉眼或解剖显微镜调节染色程度。
4) 得到预期的信号背景比之后（1〜48 h)，在PBS中洗涤组织3次，每次30 min。
5) 通过解剖镜观察和拍摄样本染色的组织，使用低功率的物镜和来自侧面和顶端的光纤照明。为了得到最好的结果，将组织放置在附有盖玻片的下陷载玻片或箱式载玻片，用足够的PBS覆盖组织。
戊二醛、甲醛、脱氧胆酸钠、亚铁氰化钾和高铁氰化物、二甲基甲酰胺、Histoclear、苯 甲酸苄酯、苯甲醇和 Perniount 是危险物质。它们的操作和处理均需按照制造商的指导。
分离小鼠胚胎和鸡的胚、组织或外植体，部分固定以保持β-半乳糖苷酶的活性，彻底洗涤去除固定剂，如果有必要可厚切片，在显色底物存在的情况下染色。 接下来，染色组织整体封片照相，样本包埋，切片，显示报道基因的细胞和组织特异性表达。强烈推荐做预备试验，这样可以估计和标准化特定试验和组织的最优化条件
1) 固定和洗涤组织。
2) 将组织放置在100 mL烧杯中，用吸管轻柔吸取大部分的洗涤缓冲液。在37〜40℃加入足够的4%中等强度的琼脂糖覆盖组织（让烧杯倾向于组织这边）。旋动烧杯混匀并使充分覆盖组织。
3) 室温将烧杯放置成45°角直到琼脂糖变硬（约10 min)。
4) 用一刀片调整琼脂糖块使之成方形，每边留出2〜3 mm。
5) 用氰基丙烯酸盐粘合剂在合适的方向（如冠状切面）粘住琼脂糖块，使之粘到振动切 片机的标本支持机托盘上。将该托盘放进振动切片机，给整个槽装满100 mmol/L的 磷酸钠盐缓冲液，pH 8.0。
6) 切片 (细节参考振动切片机手册）。小心地从振动切片机槽内移走切片，放 入β-半乳糖苷酶洗涤缓冲液直到准备染色。进行组织染色。
7) 观察和摄影染色的厚切片
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