凝胶DNA回收试剂盒说明书
| 实验方法原理 | 本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中提取多至8μgDNA（70bp-10Kb），回收率为60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A溶液)中溶解，其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解，然后在DE-B溶液的作用下使DNA选择性结合到膜上。纯化的DNA纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。 | ||||||||
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| 实验材料 | PCR产物单链DNA质粒DNA 试剂、试剂盒 | DNA凝胶回收试剂盒 仪器、耗材 | DNA制备管离心管 实验步骤 | 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 1. 说明书，耗材：DNA制备管、2ml离心管、1.5ml离心管。 2. BufferDE-A：凝胶熔化剂，含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解。室温密闭贮存。 3. BufferDE-B：结合液（促使大于70bp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上）。室温密闭贮存。若出现沉淀，应于70°C温育溶解并冷却至室温后再使用。 4. BufferW1：洗涤液，室温密闭贮存。 5. BufferW2concentrate：去盐液，使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用 100%无水乙醇或95%乙醇。 6. Eluent：2.5mMTris-HCl，pH8.5，室温密闭贮存。 二、实验准备 1. 第一次使用前，BufferW2concentrate中加入指定体积的无水乙醇。 2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。 3. 准备75°C水浴。 三、操作步骤 1. 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μl体积）。 2. 加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75°C加热（低熔点琼脂糖凝胶于40°C加热），间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化（约6-8min）。 3. 加0.5个BufferDE-A 体积的BufferDE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。 步骤4-6可以选择负压法或离心法。 A. 负压法 4A. 正确连接负压装置，将DNA制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤3中的混合液，转移到制备管中，开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。 5A. 加0.5mlBufferW1，吸尽管中溶液。 6A. 加0.7mlBufferW2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用0.7mlBufferW2洗涤一次。 * 确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 B. 离心法 4B. 吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml 离心管）中，12000×g离心1min。弃滤液。 5B.将制备管置回离心管，加0.5mlBufferW1，12000×g离心30s，弃滤液。 6B. 将制备管置回离心管，加0.7mlBufferW2，12000×g离心30s，弃滤液。（可选步骤）以同样的方法再用0.7mlBufferW2洗涤一次12,000×g离心1min。 * 确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 7. 将制备管置于2ml离心管中，12000×g离心1min。 8. 将制备管置于洁净的1.5ml 离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30μl 水或Eluent，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。 注意事项 | 1. 在步骤1中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型DNA长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。 2. 在步骤2中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA回收率。 3. 将Eluent或水加热至65°C，有利于提高洗脱效率。 4.DNA分子呈酸性，建议在2.5mMTris-HCl，pH8.5洗脱液中保存。 |
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发布于 ： 2021-07-23
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