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如何用fastdna提取试剂盒提取湿的活性污泥dna
2017-10-03
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试剂准备:使用前先在SEWS-M Wash Solution中加入100 ml 100%的乙醇,混匀。在瓶子上做好标记,密闭储存于室温条件。提取步骤:1. 在样品处理管E中加入至多500 mg的土壤样品2. 将978 μl的Sodium Phosphate Buffer加入到样品处理管E中3. 再加入122 μl的 MT Buffer(为了得到良好的样品处理效果,请在加入土壤样品及两个缓冲液后,在样品处理管中仍能保留有250 – 500μl 空间)4. 将样品置于FastPrep? 仪器上,样品处理条件一般为,时间:40秒,速度:6.0(如果样品需要额外的处理时间,请在间隔期将样品处理管在冰上孵育至少2分钟,以免样品过热)5. 14,000 x g离心5~10分钟(如果把离心时间延长到15分钟,可以更好地使样品量较大的;或者细胞壁结构较复杂的细胞的碎片沉降到管底)6. 将上清转移到一个干净的2.0 ml离心管中。加入250μL的PPS溶液(蛋白质沉淀溶液),用手摇晃10次,使之充分的混合。7. 14,000 x g离心5分钟,将上清转移到一个干净的15ml管中(此处也可使用2Ml管,但使用大管子能获得更好的混合和DNA绑定效果)8. 重悬硅珠(Binding Matrix)溶液,将1.0 ml重悬液加入该15ml管中。9. 使用振荡器或者手动震荡2分钟,将DNA绑定在硅珠上。将管子置于管架上,静置3分钟,使硅珠沉淀下来。10. 小心地移除500μl的上清液,避免吸取到沉淀下来的硅珠。11. 将硅珠在剩余的上清液中重悬。转移约600μl的重悬液至SPIN? Filter中,14,000 x g离心1分钟。弃去接液管中的废液,将15ml管中剩余的重悬液转移到SPIN? Filter再次离心弃去废液。12. 加入500 μl事先准备好的SEWS-M溶液,用枪头轻轻吹打,小心地重悬沉淀。13. 14,000 x g离心1分钟,弃去废液。14. 不加其他溶液,将SPIN? Filter 14,000 x g离心2分钟,除去残留的SEWS-M溶液。弃去接液管,更换一个新的、干净的离心管。15. 将SPIN? Filter置于室温下晾干5分钟16.轻轻地用50-100 μl 的DES溶液(或者无菌/无DNA酶的水)重悬SPIN filter上的硅珠(为了避免过度稀释纯化出的DNA,请尽量减少DES溶液的量,55?C孵育5分钟能帮助提高纯化产物的得率)17. 14,000 x g离心1分钟使溶解的DNA转移到接液管中。弃去SPIN? Filter(得到的纯化产物可直接用于PCR等其他下游的操作,4°C使用前保存或者-20°C长期保存。)技术优势能有效的处理土壤样品中一些很难处理的组分如: 真细菌孢子(eubacterial spores)、内芽孢(endospores)、格兰仕阳性菌(gram positive bacteria)、酵母(yeast)、线虫(nematodes)、海藻(algea)、真菌(fungi)等。2. 样品处理过程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整个提取过程中有效的保护核酸,并最大限度的降低RNA污染。3. 基于硅珠的纯化方法,可有效地去除腐植酸、多元酚等PCR抑制物4. 纯化所得的DNA可直接用于PCR、酶切都后续实验之中。5. 对腐植酸含量特别高的样品,附加额外的处理方法。注:对于去除腐植酸的方法在使用以下任何一种方法之前,请预先准备5.5M的异硫氰酸胍(Guanidine Thiocyanate)溶液方法A:1.当操作到土壤DNA提取试剂盒的第九步时,使用14,000 x g (~约5秒)的短时离心替代硅珠的自然沉降,移除上清。2.用1ml事先准备好的异硫氰酸胍溶液洗涤、重悬硅珠。3.14,000 x g (~约5秒)短时离心该离心管,除去上清。4.重复上述的洗涤步骤,直到硅珠恢复到原先的颜色。5.最后一次洗涤之后,用1ml的异硫氰酸胍溶液重悬硅珠,将600μl重悬液转移到SPIN filter里,14,000 x g离心1分钟。6.移除接液管中的废液,将剩余的重悬液转移至SPIN filter里,14,000 x g离心1分钟,弃去废液。7.从提取试剂盒操作说明的第十二步开始继续操作。方法B:1.将下列成分混合于1.5ml的离心管中,组成腐植酸洗涤液:978 μl Sodium Phosphate Buffer122 μl MT Buffer250 μl PPS2.充分混匀后,全速离心1分钟,将上清转移到一个新的离心管中(容量大于或等于2ml)3.加入等体积的5.5M的异硫氰酸胍溶液、混匀。4.完成了土壤试剂盒操作说明中的第九步后,将500μl的腐植酸洗涤液加入SPIN filter5.14,000 x g离心1分钟,弃去废液。6.重复上述的洗涤步骤,直到硅珠恢复到原先的颜色。7.从提取试剂盒操作说明的第十二步开始继续操作。
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